כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת חומרים
- יש לעקר את כל המכשירים ואת ddH2O באמצעות אוטוקלאבה לפני ביצוע הניסוי. המכשירים כוללים אך אינם מוגבלים למספריים כירורגיים, מספריים עיניים, מלקחיים, מחיצת גרעין כפות, כלי זכוכית (קוטר 60-100 מ"מ) וכוסות זכוכית.
- הכינו את תמיסת קרבס (טבלה 1): המסו את כל הכימיקלים עם ddH2O לפני השימוש. יש להמיס את CaCI2 בנפרד ולהוסיף באיטיות לתמיסה המעורבת תוך כדי ערבוב כדי למנוע משקעים.
- הכינו את חומר השטיפה, המורכב ממדיה F12 עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% אנטיביוטי/אנטי-מיקוטי (100x). הוסף 5 מ"ל של FBS ו 0.5 מ"ל של אנטיביוטיקה / antimycotic ל 44.5 מ"ל של מדיה F12.
- הכינו את מדיית תאי העצב A, הכוללת מדיה נוירובזלית A עם 2% B-27, 1% FBS, 1% L-גלוטמין, 1% אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית (100x) ו-0.1% גורם נוירוטרופי שמקורו בגליה (GDNF). הוסף 200 μL של B-27, 100 μL של FBS, 100 μL של L-גלוטמין, 100 μL של אנטיביוטיקה / antimycotic (100x), ו 10 μL של GDNF (10 מיקרוגרם / מ"ל) ל 9.5 מ"ל של neurobasal A media.
הערה: הכינו את מסכת תאי העצב A תוך שבוע מהשימוש כדי להבטיח טריות של B-27, L-גלוטמין ו-GDNF.
- הכן את המדיה של נוירון B באמצעות אותו הליך כמו הכנת מדיה עצבית A אך ללא הוספת FBS.
- הכינו תמיסת עיכול 1 על ידי המסת 20 מ"ג של קולגנאז מסוג II, 6 מ"ג אלבומין בסרום בקר, ו-200 מיקרוליטר אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית (100x) ב-10 מ"ל של תמיסת קרבס יציבה לחמצן.
- הכינו את תמיסת העיכול 2 על ידי דילול 1 מ"ל של 0.25% טריפסין עם 4 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של האנק.
- מכינים צלחת עם כיסויים מצופים.
- השתמש במלקחיים בספסל זרימה למינרית בעת הנחת כיסויי זכוכית לתוך צלחת תרבית של 48 בארות.
- לדלל פולי-D-ליזין עם ddH2O לריכוז של 0.1 מ"ג/מ"ל כמלאי פולי-D-ליזין. אחסנו את המלאי בטמפרטורה של -20°C והפשירו לפני
- יש להוסיף 40 μL של ציר פולי-D-ליזין על גבי כל כיסוי, ולדגור על התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
הערה: התאימו את הריכוז ל-4 מק"ג/ס"מ2 עבור לוחות שונים עם אזורי בסיס שונים. לדוגמה, אם השטח הבסיסי של באר אחת מצלחת 24 באר הוא 2 ס"מ2, עלינו להעביר 80 μL של מלאי פולי-D-ליזין בבאר. כל ס"מ2 יכיל 4 מיקרוגרם פולי-D-ליזין.
- יש להסיר את הפולי-D-ליזין בצלחת בעלת 48 הבארות, ולשטוף את הכיסויים ב-ddH2O שלוש פעמים.
- יבשו את הצלחת במכסה מנוע זרימה למינרית למשך 30 דקות לפחות כדי להבטיח שהצלחת נטולת מים.
- אחסנו את הצלחת בטמפרטורה של 4°C לפני ציפוי למינין למשך יום אחד לכל היותר. אחסון הצלחת ב -20 מעלות צלזיוס עדיף לאחסון לטווח ארוך.
- הפשיר למינין ב 4 ° C. לדלל למינין עם ddH2O לריכוז 50 מיקרוגרם / מ"ל כמו ציר למינין. יש לאחסן את המלאי בטמפרטורה של -20°C ולהפשיר בטמפרטורה של 4°C לפני השימוש.
- השתמש פיפטה כדי להעביר 100 μL של למינין מדולל לחלק העליון של כל כיסוי לדגור למינין ב 4 ° C במשך 1 h.
הערה: התאימו את הריכוז ל-5 מיקרוגרם/ס"מ2 עבור לוחות שונים עם אזורי בסיס שונים. לדוגמה, אם השטח הבסיסי של באר אחת מצלחת 24 באר הוא 2 ס"מ2, ואז להעביר 200 μL של למינין מדולל לתוך באר. כלס"מ 2 יכיל 5 מק"ג למינין.
- הסירו את תמיסת הלמינין ושטפו את הכיסויים ב-ddH2O פעם אחת. בצע פעולה זו על קצה הכיסוי כדי למנוע גירוד.
הערה: ניתן לאחסן כיסויים מצופים בטמפרטורה של 4°C למשך שבועיים לכל היותר.
2. קציר שלפוחית השתן
- השיגו חולדות ספראג-דולי בנות חמישה שבועות.
- יש להחדיר קרבוגן (95% חמצן, 5% CO2) לתמיסת קרבס למשך 30 דקות לפחות באמבט קרח כדי להגיע למצב חמצן יציב ולרמת pH
.
- לאחר המתת חסד באמצעות נקע צוואר הרחם, השרו את החולדות באתנול 75% למשך 30 שניות לצורך עיקור.
- הניחו את החולדות על מגבת כירורגית מעוקרת וחשפו את בטן. פתח את חלל הבטן וחשף את שלפוחית השתן עם קבוצה של מספריים ומלקחיים.
- הרימו את שלפוחית השתן בעדינות וחתכו את שלפוחית השתן מצוואר שלפוחית השתן עם סט נוסף של מספריים ומלקחיים כדי למנוע זיהום צולב. הניחו את שלפוחית השתן במהירות בתמיסת קרבס קרה ויציבה לחמצן כדי לשפר את הישרדות התא.
הערה: לאחר הסרת שלפוחית השתן, בצע את הפעולות הבאות במהירות כדי לשפר את סיכויי הישרדות הנוירונים.
- הוסיפו את תמיסת קרבס לשלוש כוסות זכוכית וכוסות זכוכית.
- הכינו כלי זכוכית וכוסות עם תמיסת קרבס באמבט קרח לקירור מוקדם.
- סמן גורמים מכילים אלה במספרים 1-3 בהתאמה כדי למנוע בלבול.
- שלבו כל צלחת זכוכית במלקחיים ומחיצה גרעין כפות.
- בצלחת זכוכית 1, לפתוח את שלפוחית השתן עם מספריים אופתלמיים ולפרוש אותו עם מלקחיים ומחיצת גרעין כפות.
- שוטפים את שלפוחית השתן בכוס זכוכית 1 ומניחים אותה בכלי זכוכית 2.
- לחסל שומן דבק על פני הרקמה באמצעות מלקחיים מספריים עיניים בכלי זכוכית 2.
- שוטפים את שלפוחית השתן בכוס זכוכית 2 ומניחים אותה בכלי זכוכית 3.
- יש לגרד בעדינות את שלפוחית השתן בעזרת המלקחיים ומחיצת גרעין הכפיות על צלחת זכוכית 3 כדי להסיר חיבורים אקסוגניים.
- יש לשטוף את שלפוחית השתן בכוס זכוכית 3, להעביר את שלפוחית השתן לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל עם תמיסת קרבס קרה במינון 14 מ"ל, ולסובב את הדגימה למשך דקה אחת בטמפרטורה של 356 x גרם ו-4°C.
- חזור על השלב הקודם פעמיים בשתי שפופרות אחרות עם תמיסת קרבס כדי להפחית את הזיהום.
3. עיכול שלפוחית השתן בשני שלבים
- מעבירים את שלפוחית השתן מצינור הצנטריפוגה לבקבוקון של 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של תמיסת עיכול 1. השתמש מספריים עיניים לחתוך את שלפוחית השתן לחתיכות קטנות (קטן מ 1 מ"מ) בתמיסה.
- מערבבים את תמיסת שלפוחית השתן עם 9 מ"ל של תמיסת עיכול 1 בצלחת תרבית תאים סטרילית (קוטר 100 מ"מ). בצע עיכול שלב 1 באינקובטור רועד למשך שעה אחת מתחת ל-5% CO2, 37°C ו-200 סל"ד.
- לאחר שלב 1 העיכול, צנטריפוגה את התמיסה ב 356 x גרם ב 4 ° C במשך 8 דקות.
- מניחים את תמיסת העיכול 2 באמבט מים בטמפרטורה 37°C לחימום מוקדם.
- לאחר הצנטריפוגה, מוציאים את הסופרנאטנט המכיל תמיסת עיכול 1 וקוצרו את משקעי התא. חלק מהנוזלים שנותרו מותרים. הסרה מלאה של התמיסה עלולה לקדם אובדן תאים.
- יש לערבב משקעים עם תמיסת עיכול חם 2 בצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל ולנער את התערובת תוך כדי עיכול באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. אין לחרוג מ-7 דקות של עיכול שלב 2, אחרת תאי העצב ימותו.
- לאחר העיכול, מיד להשבית טריפסין בתערובת עם 10 מ"ל של מדיה שטיפה קרה.
הערה: בצע את השלבים הבאים ב- 0 ° C - 4 ° C. אמבט קרח יכול לספק תנאים כאלה.
- קצרו את משקעי התא לאחר צנטריפוגה בטמפרטורה של 356 x גרם ב-4°C למשך 8 דקות. הסירו כמה שיותר מדיה מכיוון שהטריפסין שנותר פוגע בצמיחת התאים.
- להשהות מחדש משקעים עם 3 מ"ל של מדיה נוירון בעדינות. ודא כי בועות אוויר לא נוצרות בתמיסה המכילה תאים עבור שיעור הישרדות גבוה.
- סנן את מדיית התערובת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
- יש לשמור את התסנין על שייקר במהירות 30 סל"ד באמבט קרח למשך 30 דקות. שלב זה אינו הכרחי אך מומלץ.
- לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 356 x גרם ב 4 ° C במשך 8 דקות, ובעדינות להשעות מחדש את כדורי התא ב 1 מ"ל של נוירון מדיה A.
- מוסיפים 500 μL של תערובת תאים לכל באר של צלחת מוכן 48 בארות.
- תאי תרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- החלף את כל המדיה במדיה עצבית B תוך שעה אחת כדי לספק תרבית ללא נסיוב.
- שנה מחצית מהמדיה של תא העצב B כל 3 ימים.
הערה: תאי עצב מוכנים לניסויים אימונוציטוכימיים לאחר 5-7 ימי תרבית.
טבלה 1. הרכב פתרון קרבס
| מרכיבים | מולאריות (mM) |
| NaCI | 120 |
| KCI | 5.9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| גלוקוז | 11.5 |
