$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנה וציפוי של שבבים multicompartment
- בארון בטיחות ביולוגית, הניחו את השבב בצלוחית פטרי או במיכל סטרילי מתאים אחר.
- הוסף 100 μL של תמיסת ציפוי מראש לבאר השמאלית העליונה של השבב ואפשר לו לזרום דרך התעלה הראשית לתוך הבאר הסמוכה.
הערה: תמיסת הציפוי מראש משמשת לציפוי מראש של התעלות המיקרופלואידיות כדי לבטל את הפוטנציאל ללכידת בועות אוויר בתוך השבב.
- מלא היטב את החלק השמאלי התחתון עם 100 μL של תמיסת ציפוי מראש. המתן 5 דקות כדי לאפשר לתמיסה לזרום דרך המיקרו-חריצים.
- הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי מקדים לבאר הימנית העליונה ואפשרו לה לזרום דרך התעלה הראשית אל הבאר הסמוכה. מלא היטב את החלק הימני התחתון עם 100 μL של תמיסת ציפוי מראש.
- שאפו את הפתרון מכל באר. שאפו להתרחק מהערוצים הראשיים כדי להימנע מסילוק נוזלים מהערוצים הראשיים (איור 1A). יש להוסיף מיד 150 μL של מלח חוצץ פוספט (PBS) לבאר השמאלית העליונה. מתן 1.5 דקות
זהירות: אין לשאוב את כל הנוזלים מהערוצים הראשיים הסגורים.
- הוסף 150 μL PBS לפינה השמאלית התחתונה היטב. המתינו 5 דקות כדי לאפשר לנוזלים לזרום דרך המיקרו-חריצים. הוסף 150 μL PBS לפינה הימנית העליונה היטב. הוסף 150 μL PBS לבאר הימנית התחתונה. המתינו 10 דקות.
- חזור על שלבים 1.5-1.6 לשטיפת PBS שנייה.
- בדוק את השבב תחת מיקרוסקופ תרבית רקמה עבור בועות בערוצים הראשיים. אם קיימות בועות, בצע את ההליכים הבאים. אם אין בועות, דלג לשלב 1.9.
- שאפו PBS מהבארות, תוך הרחקת קצה הצינור מפתח התעלה (איור 1A).
- יש לפזר 100 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי מקדים לתוך הבאר העליונה, תוך זווית קצה הצינור ליד פתח התעלה (איור 1B). הבועות אמורות לנוע דרך התעלה אל הבאר התחתונה. המתינו דקה וחצי.
- חזור על שלבים 1.3-1.8.
- שאפו PBS מהבארות, תוך הרחקת קצה הצינור מפתח התעלה (איור 1A).
- הוסף 100 μL של 0.5 מ"ג / מ"ל פולי d-ליזין (PDL) לבאר השמאלית העליונה של השבב. המתינו דקה וחצי. מלא היטב את החלק השמאלי התחתון עם 100 μL של PDL.
- הוסף 100 μL של PDL לבאר הימנית העליונה של השבב. המתינו דקה וחצי. הוסף 100 μL לבאר הימנית התחתונה.
- סגור את צלחת פטרי ומניחים את השבב באינקובטור ב 37 ° C למשך 1 שעות.
- חזור על שלבי שטיפת PBS 1.5-1.6 פעמיים כדי להסיר PDL עודף.
- שאפו את ה-PBS מהמכשיר.
- מיד להוסיף 100 μL של מדיה תרבית התא לבאר השמאלית העליונה של השבב. המתינו דקה וחצי. הוסף מדיה לפינה השמאלית התחתונה היטב. הוסף מדיה לפינה השמאלית העליונה היטב. המתינו דקה וחצי. הוסף 100 μL בינוני לבאר הימנית התחתונה של השבב.
- הכניסו את השבב לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C עד שהוא מוכן לצליית תאים.
2. זריעת תאי עצב לתוך שבבים מרובי תאים
- הכינו תרחיף תאים של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדה מנותקת על פי פרוטוקולים שנקבעו כדי להניב צפיפות של ~12 × 106 תאים / mL.
הערה: שימוש בצפיפות תרחיף תאים בין 3 ל 12 × 106 תאים / מ"ל אפשרי. אם נעשה שימוש בצפיפות נמוכה יותר, ניתן להגדיל את נפח השעיית התא שיתווסף לשבב. ההליך המתואר להלן ישים עבור נוירונים קורטיקליים או היפוקמפוס מנותקים מורין. צפיפות תאים אופטימלית עבור סוגי נוירונים אחרים עשויה להשתנות.
- הסר את רוב המדיה בכל באר של השבב, משאיר כ 5 μL בכל באר. שאפו הרחק מהערוצים הראשיים כדי להימנע מסילוק נוזלים מהערוצים הראשיים (איור 1A).
זהירות: אין לשאוב נוזלים מהערוצים הראשיים הסגורים. בועות אוויר עלולות להילכד בשבב אם נוזל נשאב מהערוצים הראשיים.
- עומס 5 μL של תרחיף תאים בבאר הימנית העליונה ועוד 5 μL של תרחיף תאים בבאר הימנית התחתונה (~ 120,000 תאים בסך הכל). טען את התאים על-ידי ניפוקם קרוב לערוץ הראשי (איור 1B). בדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהנוירונים נמצאים בערוץ הראשי. המתן 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתחבר.
הערה: ניתן לטעון תאי עצב לכל אחד מהתאים. למטרות הסבר, התא הסומטי הוא התעלה הראשית בצד ימין, אך כל תא יכול לשמש כתא הסומטי. שימוש בצפיפות תאים נמוכה עד 60,000 תאים לכל שבב אפשרי. ניתן להוסיף עד 10 μL של תרחיף תאים לכל באר של התא הסומטי בשילוב עם תרחיף תאים עם פחות תאים ממה שתואר לעיל.
- הוסף כ -150 μL של מדיה של תרבית עצבית לכל אחת מהבארות הימניות העליונות והתחתונות, ולאחר מכן הוסף 150 μL של מדיה לכל באר שמאלית עליונה ותחתונה. הכניסו את השבב למגש הלח באינקובטור 5% CO2 37°C.
- לאחר 24 שעות, בצע שינוי מדיה על ידי הסרת מדיה מהבארות. ודא שהערוץ הראשי נשאר מלא. הוסף 150 μL של מדיה לכל באר עליונה, ולאחר מכן מלא את הבארות התחתונות.
- החזירו את השבב לאינקובטור למספר הימים הרצוי.
הערה: נטר את המדיה כל כמה ימים כדי לוודא שהיא נשארת ורודה בהירה. אם המדיה צהבהבה, החליפו 50% ממנה במדיה טרייה. אם רמת הנוזלים נמוכה, ודא לחות מספקת והכלה משנית מתאימה של השבבים כדי למנוע אידוי. מזעור או ביטול שינויי מדיה אפשרי באמצעות הכלה משנית ו / או כיסוי הצלחת המכילה את השבב עם יריעת פוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE)-FEP.
