גידול נוירונים של גנגליון ספירלי מורין על מערכים מרובי אלקטרודות

תקציר

מקור: Hahnewald, S., et al Spiral Ganglion Neuron Explant תרבית ואלקטרופיזיולוגיה על מערכי אלקטרודות מרובות. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את התהליך לבידוד צמחי גנגליון ספירליים מהאוזן הפנימית וטיפוחם יחד עם איבר קורטי במערך מרובה אלקטרודות. גרעיני ספירלה מופקים בקפידה ונחתכים לחלקי רקמות קטנים יותר או לצמחים. צמחים אלה מתורבתים על האזור הפעיל של מערך האלקטרודות כדי לקדם צמיחה של תהליכים עצביים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנת פתרונות לניסויים

1. הכינו את תמיסת ציפוי המטריצה החוץ תאית (ECM) (ראו טבלת חומרים): הפשירו תערובת ECM על קרח. יש לדלל את תערובת ה-ECM ביחס 1:10 במדיום תרבית בסיסי (ללא גורמים נוירוטרופיים או סרום בקר עוברי (FBS)) ולאחסן על קרח.
2. הכן את מדיום התרבית (ראה טבלת חומרים): הכן מלאי של מדיום נוירובזאלי שאינו מכיל FBS או גורם נוירוטרופי נגזר מוח (BDNF). יש להוסיף מדיה נוירובזאלית עם FBS טרי (10%) ו-BDNF (5 נ"ג/מ"ל) ממש לפני הוספה לתרבית התא.
3. הכינו את התמיסה החוץ תאית (ראו טבלת חומרים).

2. שטיפה ועיקור של MEAs

הערה: ה-MEAs ששימשו לניסויים מכילים 68 אלקטרודות שמסודרות ברשת מלבנית (איור 1E). לכל אלקטרודה גודל של 40 x 40 מיקרומטר² עם מרווח של 200 מיקרומטר מהמרכז למרכז. האלקטרודות עשויות פלטינה. האלקטרודות מחוברות למגעים המתאימים על ידי מעגל עשוי תחמוצת בדיל אינדיום. מעגל זה מבודד על ידי שכבה של 5 מיקרומטר של SU-8. ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים על הספק. פריסות MEA אחרות עשויות להתאים לניסויים אלה.

1. עבור MEAs חדשים: לשטוף אותם על ידי טבילה באתנול 70% במשך 30 שניות ולשטוף עם מים מזוקקים במשך 30 שניות. לעבוד על מכסה מנוע זרימה למינרית.
2. הניחו ל-MEA להתייבש במשך 30 דקות במכסה מנוע של זרימה למינרית.
3. הכניסו כל MEA לצלחת פטרי סטרילית נפרדת (35 מ"מ x 10 מ"מ) ואטמו בנייר כסף. ניתן לאחסן את MEAs עד לשימוש.
4. עבור MEAs משומשים: לדגור MEAs בצלחת פטרי (35 מ"מ x 10 מ"מ) המכילה 1 מ"ל של תמיסה אנזימטית (ראה טבלת חומרים) O/N על שייקר מסלולית ב RT כדי להסיר חומר ביולוגי. לאחר מכן המשך כמו בשלב 2.1.
   הערה: טפל ב- MEAs בזהירות באמצעות מלקחיים עם קצוות מכוסים גומי.

3. הכנת MEAs לניסויי תרבות

1. הסר את רדיד האיטום והשאר את MEA בצלחת פטרי (35 מ"מ x 10 מ"מ) לכל הניסוי.
2. צפו את MEAs בתמיסה שהוכנה ב-1.1: השתמשו בקצה פיפטה קר של 200 μl (מאוחסן ב-20°C-) כדי להזרים 50 μl של תמיסת ציפוי לכל MEA, המכסה את כל אזור האלקטרודה.
3. אפשר ל-MEAs לצפות במשך 30 דקות עד שעה אחת ב-RT.
4. מוציאים את תמיסת הציפוי באמצעות פיפטה. יש למרוח 100 μl של מדיום תרבית בתוספת 10% FBS ו-5ng/ml BDNF ולהשאיר אותו ב-RT עד לציפוי הרקמה.
5. מניחים 2 צלחות פטרי המכילות את MEAs המצופים לתוך צלחת פטרי גדולה (94 מ"מ x 16 מ"מ) ומוסיפים צלחת פטרי קטנה שלישית המכילה 1.5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) ללחות.
   הערה: הוספת צלחת פטרי קטנה (שלב 3.5) המכילה PBS חיונית כדי למזער באופן משמעותי את אידוי מדיום התרבית.

4. דיסקציה ספירלית של גנגליון

הערה: ניתן לבצע דיסקציה גסה מחוץ למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית (שלב 4.1 עד 4.4). עבור דיסקציה עדינה תנאים סטריליים (מכסה מנוע זרימה למינרית) הם חובה (משלב 4.5).

1. יש להרדים בעלי חיים (עכברים בני 5-7 ימים) על ידי עריפת ראשים ללא הרדמה מוקדמת.
2. לעקר את הראש על ידי ריסוס עם אתנול 70%.
3. על ידי החזקת הראש, חותכים את החיבור בין העור לגולגולת עם מספריים חדים/חדים לאורך קו הקשת.
4. חותכים את הגולגולת בצורה חדה ומוציאים את המוח בעזרת מספריים חדים/קהים.
5. חתכו את העצמות הטמפורליות מהגולגולת והניחו אותן בצלחת פטרי המכילה תמיסת מלח מאוזנת סטרילית קרה כקרח של הנקס (HBSS).
6. בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה מנתחים את הבולה הטימפנית באמצעות מלקחיים עדינים ומבודדים את האוזן הפנימית.
7. הסר את עצם השבלול, באמצעות מלקחיים עדינים.
8. הסר את הרצועה הספירלית ואת הסטריה וסקולריס (SV) יחד על ידי החזקת המלקחיים בחלק הבסיסי של הגנגליון הספירלי (SG) וה- SV ושחרר לאט את ה- SV מהבסיס לקודקוד
9. בודדו את האיבר של קורטי (OC), ה-SG והמודיולוס (איור 1A-C).
10. הפרידו את ה-OC מה-SG וה-modiolus על ידי החזקת המלקחיים בחלק הבסיסי של ה-SG וה-OC ושחררו לאט את ה-OC מהבסיס לקודקוד.
11. חתכו צמחים רוחביים (בקוטר 200 עד 500 מיקרומטר) מהגנגליון הספירלי שעדיין מחובר למודיולוס (איור 1D) באמצעות מלקחיים ואזמל מיקרו.

5. גנגליון ספירלי Explant תרבית על MEAs

1. הניחו שני עציצים של גנגליון ספירלי ליד האלקטרודות על MEA שהוכן קודם לכן עם 100 μl של מדיום תרבית.
2. מקם את האיבר של קורטי במרחק של כ -5 מ"מ מאזור האלקטרודה.
3. השתמש במלקחיים כדי להצמיד את הצמחים ואת האיבר של קורטי על MEA תוך הימנעות מפגיעה ברקמה.
4. הכניסו את MEAs בזהירות לחממה ולתרבית בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2. למחרת, בדקו ויזואלית שהצמחים התחברו ל-MEA.
   הערה: אם הצמחים לא חיברו O/N, הם יעשו זאת רק לעתים רחוקות במהלך הימים הקרובים. הOC ממוקם בסמוך לתרבית לתמיכה טרופית/נוירוטרופית.
5. הוסף 100 μl של מדיום תרבית המכיל 10% FBS ו- BDNF מדי יום במשך 5 ימים רצופים.
6. ביום השישי, יש להוסיף 2 מ"ל מדיום תרבית המכיל 10% FBS ו-5ng/ml BDNF ולגדל את הרקמה בתרבית למשך 13 ימים נוספים.

תוצאות

איור 1. הכנת תרבית תאים. (A) אוזן פנימית של עכבר שזה עתה נותח. קו מקווקו לבן מציין את מיקום השבלול, קו מקווקו שחור מציין את אזור שיווי המשקל. (B) האוזן הפנימית של העכבר לאחר הסרת דופן השבלול הגרמי. סיבובי השבלול מסומנים בקווים מקווקווים לבנים. (C) הגנגליון הספירלי (SG) והמודיולוס, האיבר של קורטי (OC) והסטריה וסקולריס (SV) והליגמנט הספירלי מוצגים לאחר דיסקציה. (D) סכמטי של דיסקציה SG ו-OC והכנת SG exp...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיום נוירובזאלי	Invitrogen	21103-049	24 מ"ל (עבור 25 מ"ל)
HEPES	Invitrogen	15630-080	250 מיקרוליטר (עבור 25 מ"ל)
גלוטמקס	Invitrogen	35050-061	250 מיקרוליטר (עבור 25 מ"ל)
B27	Invitrogen	17504-044	500 מיקרוליטר (עבור 25 מ"ל)
פ.ב.ס.	גיבקו	10099-141	10% (עבור 25 מ"ל)
BDNF	מערכות מו"פ	248-BD-025/CF	סופי 5 נ"ג/מ"ל (עבור 25 מ"ל)
NaCl			145 מ"מ
KCl			4mM
MgCl2			1 מ"מ
CaCl2			2 מ"מ
HEPES			5 מילימטר
נא-פירובט			2 מ"מ
גלוקוז			5 מילימטר
PBS	Invitrogen	10010023
BSA	סיגמא	A4503-50G	2%
טריטון X-100	סיגמא	X100	0.01%
צלחת פטרי 35 מ"מ	הוברלאב	7.627 102
צלחת פטרי 94 מ"מ	הוברלאב	7.633 180
פינצטה Dumont #5	WPI	14098
פינצטה Dumont #55	WPI	14099
פתרון אנזימטי: Terg-a-Zyme	סיגמא	Z273287-11 ק"ג
תערובת מטריצה חוץ-תאית (ECM): Matrigel TM	קורנינג	356230
אלקטרודות MEA	Qwane Biosciences		(לוזאן, שוויץ)