תכנות מחדש עצבי ישיר של אסטרוציטים עכבריים לתאי עצב

תקציר

מקור: Hersbach, B. A. et al., בידוד ותכנות מחדש עצבי ישיר של אסטרוציטים עכברים. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מציג תכנות מחדש ישיר של אסטרוציטים המבטאים גורמים טרנספורמטיביים לנוירונים. גורמי טרנספורמציה מעוררים שרשרת של אירועים מולקולריים המאפשרים המרת אסטרוציטים לנוירונים. התהליך נתמך עוד יותר על ידי אספקת סוכנים ספציפיים ותוספי מזון באמצעות מדיום התמיינות עצבית.

פרוטוקול

1. זריעת אסטרוציטים לתכנות מחדש

הערה: את השלבים הבאים יש לבצע תחת ארון בטיחות ביולוגי עם רמת בטיחות 1 (SL1).

1. הכינו צלחות 24 בארות עם כיסויי זכוכית מצופים פולי-D-ליזין באותו אופן שבו הוכנו צלוחיות תרבית בעבר. כדי לקבוע את מספר הלוחות הדרושים, קחו בחשבון כי אסטרוציטים מצופים בצפיפות של 5-5.5 x 10⁴ תאים לכל באר בלוח של 24 בארות. בדרך כלל, בידוד שישה חוטי שדרה מעכברי יום 2 (P2) לאחר הלידה מניב סביב 1 x 10⁶ תאים.
2. יש לשאוב מדיה מצלוחיות תרבית T25 המכילות את האסטרוציטים המתורבתים ולשטוף פעם אחת עם 1x מלח חוצץ פוספט (PBS). נתקו את האסטרוציטים מבקבוק התרבית על ידי הוספת 0.5 מ"ל של 0.05% טר....

תוצאות

איור 1: סקירה כללית של תרבית אסטרוציטים ותכנות מחדש. (א)ציר הזמן של המרה ישירה של אסטרוציטים לנוירונים. כל קו שחור מייצג שלב חשוב בפרוטוקול. (B) תמונות שדה בהיר מייצגות של אסטרוציטים שמקורם בעמוד השדרה לאחר 7 ימים בתרבית. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ומטרה פי 10. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. (C) תמונות שדה בהיר מייצגות של אסטרוציטים מחוט השדרה יום אחד לאחר ציפוי מחדש בצפיפות של 5.5 .......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.05% טריפסין/EDTA	לייף טכנולוגיות	25300054
תוסף B27	לייף טכנולוגיות	17504044
bFGF	לייף טכנולוגיות	13256029
DMEM/F12	לייף טכנולוגיות	21331020
דורסומורפין	סיגמא אולדריץ'	P5499
EGF	לייף טכנולוגיות	PHG0311
סרום בקר עוברי	פאן ביוטק	עמ' 30-3302
פורסקולין	סיגמא אולדריץ'	F6886
Lipofectamine 2000 (מגיב טרנספקציה)	תרמו פישר	חתול# 11668019
OptiMEM – GlutaMAX (מדיום מופחת סרום)	תרמו פישר	חתול# 51985-026
פניצילין/סטרפטומיצין	לייף טכנולוגיות	15140122
פולי-די-ליזין	סיגמא אולדריץ'	עמ' 1149