תכנות מחדש עצבי ישיר של אסטרוציטים עכבריים לתאי עצב

תקציר

מקור: Hersbach, B. A. et al., בידוד ותכנות מחדש עצבי ישיר של אסטרוציטים עכברים. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מציג תכנות מחדש ישיר של אסטרוציטים המבטאים גורמים טרנספורמטיביים לנוירונים. גורמי טרנספורמציה מעוררים שרשרת של אירועים מולקולריים המאפשרים המרת אסטרוציטים לנוירונים. התהליך נתמך עוד יותר על ידי אספקת סוכנים ספציפיים ותוספי מזון באמצעות מדיום התמיינות עצבית.

פרוטוקול

1. זריעת אסטרוציטים לתכנות מחדש

הערה: את השלבים הבאים יש לבצע תחת ארון בטיחות ביולוגי עם רמת בטיחות 1 (SL1).

1. הכינו צלחות 24 בארות עם כיסויי זכוכית מצופים פולי-D-ליזין באותו אופן שבו הוכנו צלוחיות תרבית בעבר. כדי לקבוע את מספר הלוחות הדרושים, קחו בחשבון כי אסטרוציטים מצופים בצפיפות של 5-5.5 x 10⁴ תאים לכל באר בלוח של 24 בארות. בדרך כלל, בידוד שישה חוטי שדרה מעכברי יום 2 (P2) לאחר הלידה מניב סביב 1 x 10⁶ תאים.
2. יש לשאוב מדיה מצלוחיות תרבית T25 המכילות את האסטרוציטים המתורבתים ולשטוף פעם אחת עם 1x מלח חוצץ פוספט (PBS). נתקו את האסטרוציטים מבקבוק התרבית על ידי הוספת 0.5 מ"ל של 0.05% טריפסין/חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. טפחו בעדינות על צד הבקבוק כדי לשחרר תאים משטח בקבוק התרבית ובדקו את הניתוק תחת מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות הגדלה של פי 10.
3. עצור טריפסיניזציה עם 2.5 מ"ל של מדיום תרבית אסטרוציטים ולאסוף תרחיף תאים בצינורות 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות, לשאוף סופרנטנט, ולהשהות תאים ב 1 מ"ל של מדיום תרבית אסטרוציטים. חשב את ריכוז התא באמצעות המוציטומטר או מערכת ספירת תאים אוטומטית.
4. בהתבסס על מספר התאים, לדלל את השעיית התא עם מדיום אסטרוציטים טריים כדי לקבל פתרון של 1-1.1 x 105 תאים לכל מ"ל. יש להשלים את המדיום עם גורם גדילה אפידרמלי (EGF) וגורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) ב-10 ננוגרם/מ"ל לכל גורם. הוסף 500 μL של תרחיף תאים, שווה ערך ל 5-5.5 x 10⁴ תאים, לכל באר של לוחות 24 בארות שהוכנו בעבר ותאי תרבית ב 37 ° C ו 5% CO₂.

2. ביטוי כפוי של גורמי שעתוק

הערה: לפני שתמשיך עם הפרוטוקול, חיוני לתכנן כראוי את הניסוי. בפרט, חשוב תמיד לכלול שליטה שלילית עבור תכנות מחדש, כלומר מצב שבו לא גורם תכנות מחדש בא לידי ביטוי. לדוגמה, כאשר משתמשים בווקטורים הנושאים את ה-cDNA עבור גורם התכנות מחדש ובמדווח (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), DsRed, הבקרה השלילית מיוצגת על ידי אותו וקטור הנושא רק את המדווח. כאשר מבטאים מספר גורמים הנושאים כתבים שונים, הבקרה השלילית צריכה להיות מותאמת בהתאם.

1. יום לאחר הציפוי, בדקו את לוחות 24 הבארות כדי לוודא שהתאים נצמדו לכיסויים.
2. בהתבסס על מטרת הניסוי והמשאבים הזמינים, ניתן להשיג את הביטוי הכפוי של גורמי תכנות מחדש על ידי התמרה ויראלית (ראה שלב 2.3) או טרנספקציה של DNA (ראה שלב 2.4).
   הערה: השימוש ברטרו-וירוס או בלנטיוירוס דורש אישור של רשויות ממשלתיות וחייב להתבצע תחת ארון בטיחות ביולוגי בתוך מעבדה עם רמת בטיחות 2 (SL2).
3. תכנת מחדש את האסטרוציטים על ידי העברת התאים עם הרטרו-וירוס או הלנטיוירוס הנושא את המידע הגנטי כדי לבטא את גורמי התכנות מחדש המעניינים כמתואר להלן.
   1. לתמר תאים עם titer וירוס גבוה של 1 x^{10 10-1} x 10¹² חלקיקים / מ"ל על ידי הוספת 1 μL של תרחיף התא ישירות למדיום האסטרוציטים. זה מבטיח שיעור הדבקה גבוה. תרבית את התאים עם תווך אסטרוציטים המכיל חלקיקים נגיפיים ב 37 ° C במשך 24-36 שעות לפני שתמשיך עם סעיף 3, בהתאם למטרת הניסוי.
      הערה: ניתן להשתמש במקדמים שונים כדי להניע את הביטוי של הטרנסגנים (ראה גם תוצאות מייצגות). מקדמים מכוננים {למשל, ציטומגלווירוס (CMV), עוף β-אקטין (CAG)} גורמים לביטוי של הטרנסגן מוקדם יותר מאשר מקדמי השראות; עם זאת, שני סוגי המקדמים שימשו בהצלחה כדי לתכנת מחדש תאים לנוירונים.
4. פלסמידים של DNA יכולים גם להיות מוחדרים לאסטרוציטים באמצעות טרנספקציה של DNA כמתואר להלן.
   הערה: ניתן לעשות זאת תחת ארון בטיחות ביולוגי המאושר ל-SL1.
   1. לפני הטרנספקציה, השג את מגיב הטרנספקציה, DNA פלסמיד של המבנים הרצויים, מדיום אסטרוציטים טרי ומדיום מופחת בסרום (ראה טבלת חומרים). חשב את הכמות הנדרשת של מדיום מופחת בסרום (ראה טבלת חומרים) על ידי התחשבות בכך שכל באר של צלחת 24 בארות דורשת 300 μL של מדיום מופחת בסרום. הוסיפו את הכמות המתאימה של מדיום מופחת בסרום לצינור של 50 מ"ל וחממו אותו ל-37°C.
   2. כאשר התווך מופחת הסרום חם, שאפו תווך אסטרוציטים מכל הבארות ואספו אותו בצינור של 50 מ"ל. סנן את מדיום האסטרוציטים שנאסף באמצעות מסנן מזרקים של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר תאים מנותקים.
   3. הוסף נפח שווה של תווך אסטרוציטים טרי למדיום המסונן כדי לקבל תמיסה המספיקה כדי להוסיף 1 מ"ל של מדיום אסטרוציטים לכל באר. שמור על התווך המותנה אסטרוציטים באינקובטור ב 37 ° C עד לשימוש (שלב 2.4.9).
      הערה: מדיום התרבות נמצא בשימוש חוזר מכיוון שהוא מכיל מספר גורמים מופרשים התומכים ביכולת הקיום של התרבות.
   4. מוסיפים 300 μL של מדיום מופחת סרום שחומם מראש לכל באר ומחזירים את צלחת 24 הבארות לאינקובטור.
   5. הכינו תמיסה A, המורכבת מדנ"א ומדיום מופחת בסרום. עבור כל באר, השתמש בסך הכל 0.6 מיקרוגרם של DNA ולהוסיף אותו 50 μL של מדיום מופחת בסרום. יש לאחסן תמיסה A בטמפרטורת החדר עד לשימוש.
      הערה: בדרך כלל, משולש טכני לכל תנאי נחשב. לכן, מכינים תערובת המספיקה לתגובה של 3.5 (למשל, 2.1 מיקרוגרם של דנ"א מדולל ב-175 מיקרוליטר של תווך מופחת בסרום) כדי להבטיח מספיק חומר כדי להדביק שלוש בארות של צלחת בת 24 בארות.
   6. הכינו תמיסה B, המורכבת מגיב טרנספקציה ומדיום מופחת בסרום. עבור כל באר, להוסיף 0.75 μL של מגיב transfection ל 50 μL של מדיום מופחת בסרום. מכיוון שפתרון זה משותף לכל תנאי הטרנספקציה, הכינו אותו בכמויות גדולות כדי להפחית את השונות בין טרנספקציות.
   7. יש לדגור על תמיסה B בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. להוסיף תמיסה B לתמיסה A טיפה אחר טיפה ביחס של 1:1 ולערבב בעדינות. אין לערבל. יש לדגור על תמיסה A+B למשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר מתחת למכסה המנוע.
   8. חזור על שלב 2.4.5-2.4.7 עבור כל תנאי הטרנספקציה. לאחר 20-30 דקות, הוסיפו תמיסה A+B לכל באר טיפה אחר טיפה לקבלת נפח סופי של 100 μL. נערו בעדינות את הצלחת והחזירו את התאים לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך 4 שעות.
   9. לאחר 4 שעות, הסר את מדיום הטרנספקציה והוסף 1 מ"ל של המדיום המותנה אסטרוציטים שחומם מראש שהוכן בשלב 2.4.3. שמור על תאים במשך 36-48 שעות לפני שתמשיך עם סעיף 3, בהתאם למטרת הניסוי.

3. תכנות מחדש של אסטרוציטים (ניתוח של 7 ימים)

1. הכן מדיום התמיינות עצבית על ידי הוספת 1 מ"ל של תוסף B27 ל 49 מ"ל של מדיום תרבית בסיסי. לאחר 24-48 שעות, תלוי אם תאים עברו טרנספורמציה או הדבקה (ראה שלבים 2.3 ו -2.4, בהתאמה), להחליף מדיום אסטרוציטים עם 1 מ"ל של מדיום התמיינות עצבית לכל באר ותאי תרבית ב 37 ° C ו 9% CO₂.
   הערה: תאים יכולים גם להישמר ב 5% CO₂ אם אין אינקובטור 9% CO₂ זמין. עם זאת, תכנות מחדש של תאי עצב יעיל יותר בתנאים אלה.
2. אופציונלי: כדי להגביר את יעילות התכנות מחדש, להשלים את מדיום התמיינות עצבית עם Forskolin (ריכוז סופי של 30 μM) ו Dorsomorphin (ריכוז סופי של 1 μM) בעת החלפת מדיום אסטרוציטים למדיום התמיינות. כאשר בוחרים לטפל בתאים עם Forskolin ו Dorsomorphin, לספק מנה שנייה של Dorsomorphin 2 ימים לאחר הטיפול הראשוני. הוסיפו את הטיפול השני ישירות למדיום התרבית.
3. תכנות מחדש ישיר של אסטרוציטים מורינים לתאי עצב מתרחש בדרך כלל תוך 7 ימים לאחר שינוי התווך (איור 1). לפיכך, 7 ימים לאחר תחילת תכנות מחדש עצבי, לתקן או לאסוף תאים עבור ניתוח במורד הזרם.

תוצאות

איור 1: סקירה כללית של תרבית אסטרוציטים ותכנות מחדש. (א)ציר הזמן של המרה ישירה של אסטרוציטים לנוירונים. כל קו שחור מייצג שלב חשוב בפרוטוקול. (B) תמונות שדה בהיר מייצגות של אסטרוציטים שמקורם בעמוד השדרה לאחר 7 ימים בתרבית. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ומטרה פי 10. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. (C) תמונות שדה בהיר מייצגות של אסטרוציטים מחוט השדרה יום אחד לאחר ציפוי מחדש בצפיפות של 5.5 ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.05% טריפסין/EDTA	לייף טכנולוגיות	25300054
תוסף B27	לייף טכנולוגיות	17504044
bFGF	לייף טכנולוגיות	13256029
DMEM/F12	לייף טכנולוגיות	21331020
דורסומורפין	סיגמא אולדריץ'	P5499
EGF	לייף טכנולוגיות	PHG0311
סרום בקר עוברי	פאן ביוטק	עמ' 30-3302
פורסקולין	סיגמא אולדריץ'	F6886
Lipofectamine 2000 (מגיב טרנספקציה)	תרמו פישר	חתול# 11668019
OptiMEM – GlutaMAX (מדיום מופחת סרום)	תרמו פישר	חתול# 51985-026
פניצילין/סטרפטומיצין	לייף טכנולוגיות	15140122
פולי-די-ליזין	סיגמא אולדריץ'	עמ' 1149