$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הסרת מוח עם שורש עצב שמיעה שלם לגירוי
הערה: עכברים עבור ניסויים אלה הושגו על ידי חציית עכברים טרנסגניים ChAT-IRES-Cre על רקע C57BL/6J עם עכברי כתב tdTomato (Ai14). עכברים ששימשו להיסטולוגיה ולאלקטרופיזיולוגיה היו לאחר הופעת שמיעה (P14-P23), שזה בערך P12 בעכברים. תאי עצב המבטאים tdTomato בגרעין הגחון של גוף הטרפז (VNTB) אופיינו בעבר כנוירונים אוליבוקוכלריים מדיאליים (MOC) בקו עכבר זה.
- הרדימו (למשל, חנקCO2) וערפו את ראשו של בעל החיים באמצעות הליכים מוסדיים מאושרים.
- באמצעות סכין גילוח, לחתוך את העור בקו האמצע של הגולגולת מן האף אל החלק האחורי של הצוואר. מקלפים בחזרה את העור כדי לחשוף את הגולגולת.
- בעזרת מספריים קטנים, לבצע חתך בגולגולת דרך קו האמצע, החל בבסיס (קצה קאודלי ליד חוט השדרה) של הגולגולת וממשיך לכיוון האף.
- בתפר הלמדא מבצעים חתכים בגולגולת מקו האמצע, לרוחב לכיוון האוזן משני הצדדים. מקלפים בחזרה את הגולגולת כדי לחשוף את המוח.
- החל מהקצה הרוסטרלי, הרימו בעדינות את המוח הרחק מהגולגולת בעזרת מרית מעבדה קטנה או מלקחיים קהים. חתכו את עצב הראייה והמשיכו לעבוד בעדינות את המוח לאחור, תוך חשיפת משטח הגחון.
- חתכו את העצבים הטריגמינליים על ידי צביטה שלהם עם מלקחיים עדינים ליד פני השטח הגחוני של גזע המוח.
הערה: עשו זאת בזהירות, מכיוון שעצב שיווי המשקל נמצא ממש מתחת לזה וצריך להיות שלם לגירוי בסופו של דבר.
- מניחים את ההכנה בצלחת פטרי זכוכית מלאה בתמיסת חיתוך קרה. מניחים את התבשיל מתחת למיקרוסקופ מנתח. מבעבעים בעדינות עם קרבוגן.
- חותכים את עצב הפנים קרוב לגזע המוח וחושפים את עצב שיווי המשקל.
- בעזרת מלקחיים עדינים, דוחפים את הקצוות לתוך הפורמינה שבה עצב שיווי המשקל יוצא מהגולגולת רחוק ככל האפשר וצובטים את העצב כדי לקטוע אותו, ומשאירים את שורש העצב מחובר לגזע המוח. חזור על כך בצד השני.
- ברגע ששני שורשי העצבים חופשיים, הסירו את קרומי המוח וכלי הדם מהמשטח הגחוני של גזע המוח ליד גוף הטרפז.
- שחררו את המוח לחלוטין מהגולגולת על ידי צביטת עצבי הגולגולת הנותרים ורקמת החיבור תוך הקפדה על שימור חוט השדרה הנותר במידת האפשר.
2. לחסום ולהרכיב מוח על הבמה (דיסק מגנטי)
- הכן את פני השטח של המוח כדי לתקן לשלב על ידי חסימת המוח ברמה של כיאזמה אופטית.
- כאשר משטח הגחון למעלה, ייצב את המוח באמצעות כלי קהה כדי לשתק בעדינות את חוט השדרה כך שהמוח לא יטה במהלך השלב הבא.
- ברמת הכיאזמה האופטית, השתמשו במלקחיים פתוחים כדי ליצור את המישור לחסימת המוח על ידי החדרה דרך המוח לתחתית המנה. הכנס את המלקחיים בזווית של כ -20° מאנכי כך שהקצוות יוצאים מהמשטח הגבי של המוח הקאודלי אל הכיאזמה האופטית.
- חותכים לאורך המלקחיים באמצעות סכין הגילוח.
- הדביקו את המוח לפני השטח של הבמה.
- הכינו גוש קטן (~ 1 ס"מ3) של 4% אגר לתמיכה במוח.
- הניחו טיפה קטנה של דבק על הבמה ופזרו אותה למלבן כך שניתן יהיה להדביק גם את המוח וגם את גוש האגר.
- בעזרת מלקחיים, הרימו בזהירות את המוח וטפחו בעדינות את עודפי הנוזל באמצעות קצה מגבת נייר. הניחו את המשטח החסום על הדבק, משטח הגחון יהיה לכיוון הלהב במהלך החיתוך.
- דחפו את גוש האגר בעדינות כנגד המשטח הגבי של המוח כדי לתמוך בו במהלך החיתוך וכדי להבטיח מיקום נכון של המוח (כלומר, זווית).
3. פורסים מוח ליצירת פרוסת טריז
הערה: הכינו פרוסת מוח באמצעות ויברטומה הכוללת את שורש עצב השבלול בצד העבה ואת תאי העצב האוליבוקוכלריים המדיאליים (MOC) ואת הגרעין המדיאלי של גוף הטרפז (MNTB) בצד הדק.
- הניחו את הדיסק המגנטי עם המוח המחובר על בסיס הבמה והניחו אותו בתא החיתוך כאשר המשטח הגחוני של המוח מכוון לכיוון הלהב.
- ממלאים את התא בתמיסת חיתוך קרה כקרח ומבעבעים בקרבוגן.
- מורידים את הלהב לתמיסה וחותכים פרוסות לאזור העניין כדי לוודא שהפרוסות סימטריות. אם הפרוסות נראות לא סימטריות, הטו מעט את הבמה לקבלת סימטריה.
הערה: מהירויות להב בין 0.05-0.10 מ"מ לשנייה היו יעילות לחיתוך פרוסות בריאות ועשויות להשתנות בהתאם לגיל בעל החיים ולאזור המוח.
- ברגע שהפרוסות סימטריות, הזיזו את השלב ~15° (המקביל לכ-3 טבעות קונצנטריות בבסיס הבמה) לצד אחד.
הערה: הזיזו את השלב הרחק משורש עצב השמיעה שברצונכם לשמר בפרוסה.
- ממשיכים לחתוך בזהירות עד ששורש עצב השמיעה קרוב לפני השטח בצד אחד, וניתן לראות את עצב הפנים על פני השטח של הצד השני.
- הזז את הבמה 15° אחורה למיקום המקורי.
- הרחיקו את הלהב מהרקמה וסובבו את בסיס הבמה ב-90° כך שהקצה הצידי של הצד הדק פונה אל הלהב. מנמיכים את הלהב כמה מאות מיקרונים ואז מקרבים את הלהב לאט לקצה הרקמה. חזור על פעולה זו עד שהלהב נוגע בקצה הרוחבי. מנמיכים את הלהב לעובי הרצוי של הקצה הדק של הפרוסה, כאן עוד מאתיים מיקרון.
הערה: הפרוסה המתקבלת היא באופן אידיאלי ~ 300 מ"מ עובי ברמה של גרעין הגחון של גוף הטרפז (VNTB) בצד שבו הידוק טלאי יתבצע.
- הרחיקו את הלהב מהרקמה וסובבו את בסיס הבמה לאחור כך שמשטח הגחון פונה אליו.
- בצע את החיתוך המייעד את פני השטח הרוסטרליים של פרוסת הטריז. מעבירים את הפרוסה לפיסת נייר ממשק (1 ס"מ2) משטח קאודלי כלפי מטה. מעבירים את הפרוסה לתא הדגירה או למנגנון דגירה מתאים אחר להתאוששות (30 דקות ב-35°C).
הערה: עצב הפנים צריך להיות גלוי בשתי ההמיספרות של הפרוסה על פני השטח הרוסטרליים (ראו איור 1B).
