גירוי התמיינות תאי עצב באמצעות ננו-מוטות זהב

תקציר

מקור: Paviolo., et al. גירוי אופטי בסיוע ננו-מוט זהב של תאים עצביים. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים טכניקה לקידום התמיינות עצבית על ידי חשיפת תאי עצב לננו-מוטות זהב ואור לייזר, אשר יוצרים הקרנות תאים הנתמכות על ידי βIII-tubulin. צביעה והתבוננות בטובולין ובגרעין התא במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי חושפת את צמיחת התא, דבר המצביע על יעילות הננו-מוטות בהתמיינות עצבית.

פרוטוקול

1. NG108-15 תרבית קו תאי עצב והתמיינות

1. עבור מדיום תרבית התא, הכינו 500 מ"ל של מדיום הנשר הסטרילי של דולבקו (DMEM) המכיל 10% (w/v) סרום עגל עובר (FCS), 1% (w/v) L-גלוטמין, 1% (w/v) פניצילין/סטרפטומיצין ו-0.5% (w/v) אמפוטריצין B.
   הערה: תוספי מזון ניתן aliquoted, מאוחסן ב -20 °C, והוסיף למדיה ביום הנדרש. מדיום תרבית תאים יכול להיות בקירור במצב סטרילי לכל היותר 1 חודש.
2. עבור מדיום התמיינות התא, להכין 50 מ"ל של DMEM סטרילי המכיל 1% (w/v) L-גלוטמין, 1% (w / v) פניצילין/סטרפטומיצין, ו 0.5% (w / v) אמפוטריצין B.
3. לגדל NG108-15 תאים עצביים ב 10 מ"ל של מדיום תרבית תאים בצלוחיות T75 עשויות פוליסטירן באינקובטור עם אטמוספירה לחה (5% CO2 ב 37 ° C). בדרך כלל, זרע 1.5-2 × 10⁵ תאים בכל בקבוק כדי להיות מוכן בתוך 3-4 ימים. שנה את מדיום תרבית התאים כל יומיים.
   הערה: כדי למנוע סחף גנטי או שונות, אין להשתמש בתאים ישנים יותר ממעבר 21 לניסויים.
4. כאשר 70-80% נפגשים בתרבית, לשנות את המדיום עם מדיום תרבית תאים טרי חם. נתקו מכנית את התאים על ידי דפיקה עדינה של תחתית הצלוחית. אין להשתמש בטריפסין.
5. צנטריפוגה את תרחיף התא למשך 5 דקות ב 600 x גרם ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 2 מ"ל של מדיום התמיינות תאים חמים.
6. זרעים 2 × 10⁴ תאים / ס"מ² בתרבית רקמה פוליסטירן 96 צלחת באר עם 200 μl של מדיום התמיינות תאים. לדגור על הניסוי במשך יום אחד ב 5% CO2 / 37 ° C.
7. הוסף בין 3.2 × 10⁹ - 4.2 ×^{10 10} חלקיקים/מ"ל של תמיסת ננורוד זהב (Au NR) ביום השני ודגור עליה למשך 24 שעות נוספות. אל תוסיף את החלקיקים לניסויי הבקרה.
   הערה: כבקרה חלופית, ננו-חלקיקי זהב (Au NPs) עם אורך גל בליעת שיא ממוין היטב יכולים לשמש למטרות השוואה, להתנהגות תאים עקבית יותר, שמור על צפיפות התא קבועה ואל תשנה את פני השטח של הבאר לפני זריעת התא.

2. שיפור צמיחת עצבים

1. שלב את הלייזר עם סיב אופטי במצב יחיד (צמצם מספרי = 0.13) וסיים אותו עם מחבר סיב (מחברי FC נוחים וזמינים בדרך כלל). מדוד את עוצמת לייזר הפלט באמצעות מד הספק סטנדרטי. כדי להשיג את התוצאות היעילות ביותר, התאימו את שיא אורך הגל של הלייזר לשיא התהודה הפלסמונית של ה-NRs.
2. ביום השלישי לאחר הדגירה של NR, תקן את מחבר FC לבאר. הקרינו דגימות ובקרות ב-RT למשך דקה אחת בגל רציף לקבלת עוצמות לייזר שונות. אפשר לתרבית להמשיך במשך 3 ימים נוספים ב 5% CO2 / 37 ° C. חזור על הקרנת הלייזר למשך 3 מדידות עצמאיות לפחות.
   הערה: ניתן לבחור זמני קרינה ותדרי פולס שונים בהתאם ליישום.
3. אפיינו את הלייזר מבחינת קוטר הקרן וקרינת לייזר (W∙cm-2).
   1. עבור סיב חד-מצבי סטנדרטי, השתמשו ב-NA = n∙sinθ, כאשר n הוא מקדם השבירה של התווך שנמצא בשימוש ו-θ הוא חצי הזווית של חרוט האור היוצא מהסיב (ראו איור 1A). מטריגונומטריה, r = tanθ∙d, כאשר are הוא רדיוס הקרן ו- d הוא המרחק בין הסיב לדגימה. מחבר FC תואם את קוטר הבאר, ולכן מאיר את המדגם במרחק d = 2.70 ± 0.20 מ"מ. האור יוצא מהסיב במים (n = 1.33), נותן r = tan(sin-1(NA/n))∙d.
   2. באמצעות המשוואה האחרונה, חשבו את רדיוס קרן הלייזר, את שטח הקרן המתאים ואת קרינת הלייזר הממוצעת (עוצמת לייזר חלקי שטח הקרן) במטרה (ראו גרף לדוגמה באיור 1B). ערכים אלה מייצגים את הקרינה הממוצעת מעל האזור המואר.
   3. להעריך את השגיאות עבור המדידות עם התאוריה הכללית של התפשטות שגיאות.
      הערה: ניתן למדוד את המרחק בין מחבר FC לדגימה על ידי צילומים של סידור הניסוי ועיבוד התמונה לאחר מכן באמצעות תוכנה מתאימה (למשל ImageJ).
4. ביום 5, הסר את מדיום התמיינות התאים מהניסויים וקבע את הדגימות עם תמיסת פורמלדהיד 3.7% (v/v) למשך 10 דקות, ולאחר מכן חלחל לתאים עם 0.1% (v/v) Triton X-100 למשך 20 דקות.
5. הוסיפו אלבומין בסרום בקר (BSA) של 3% (w/v) לדגימות למשך 60 דקות כדי לחסום את אתרי קשירת החלבונים שלא מגיבים. יש לתייג את הדגימות עבור אנטי-βIII-טובולין למשך הלילה (5 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS בתוספת 1% BSA) ב-4°C.
6. יש לדגור על התאים במשך 90 דקות בחושך עם נוגדן משני מתאים (למשל נוגדן IgG מצומד נגד עכבר TRITC (Tetramethylrhodamine) באמצעות ריכוז של 0.4-2 מיקרוגרם/מ"ל ב-1% BSA ב-PBS. תייג את גרעיני התא עם DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) (0.1 מיקרוגרם/מ"ל במים דה-מיוננים) למשך 10 דקות.
   הערה: הצמידות והריכוז של נוגדנים עשויים להשתנות בהתאם לפרוטוקול החברה. יש לשטוף את הדגימות עם PBS פעמיים למשך 5 דקות לאחר כל שלב צביעה.
7. דגימות תמונה על ידי אפיפלואורסצנטיות או מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מטרה של 20× לפחות. בחרו את מסנני המיקרוסקופ בהתאם לנוגדן המשני. בחר מסנן DAPI (λEX = 358 ננומטר; λEM = 488 ננומטר) כדי להציג באופן חזותי את גרעיני התא.
8. נתח את התמונות על-ידי הערכה: i) אורך הנוריט המרבי (רשום את האורך מקצה הנוריט לתחילת גוף התא), ii) מספר הנוריטים לכל תא עצבי (סכם את כל הנוירוריטים בכל תא) ו-iii) אחוז התאים עם נוירוטים (חלק את המספר הכולל של תאים המבטאים βIII-tubulin במספר הכולל של תאים עם גרעין מוכתם חיובי)

תוצאות

איור 1. מערך ניסיוני של סיבים אופטיים (A) וממוצע קרינת לייזר כפונקציה של עוצמת הלייזר עבור קרן לייזר בשטח שווה ל-0.4 מ"מ2 (B). פרמטרי הקרן הם (A): חצי הזווית של חרוט האור המרבי היוצא מהסיב (θ), רדיוס הקרן (r) והמרחק בין הסיב האופטי לדגימה (d).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Au NR	סיגמא אולדריץ'	716812
NG108-15	סיגמא אולדריץ'	8811230
DMEM	סיגמא אולדריץ'	D6546
FCS	לייף טכנולוגיות	10100147
ל-גלוטמין	סיגמא אולדריץ'	G7513
פניצילין/סטרפטומיצין	לייף טכנולוגיות	15140122
אמפוטריצין ב	לייף טכנולוגיות	15290018
פורמלדהיד	סיגמא אולדריץ'	F8775
טריטון X-100	ב.ד.ה	T8532
BSA	סיגמא אולדריץ'	A2058
אנטי-βIII-טובולין	פרומגה	G7121
נוגדן IgG מצומד TRITC נגד עכבר	סיגמא אולדריץ'	T5393
דאפי	Invitrogen	D1306
ספקטרומטר UV-Vis	Varian מערכות רפואיות בע"מ	קרי 50 ביו
מיני צנטריפוגה	אפנדורף	מיני ספין
אמבט סוניק	Unisonics, אוסטרליה	FPX 10D
אינקובטור תרביות תאים	קנדרו	תא הרה 150
צנטריפוגת תרבית תאים	הטיך	רוטופיקס 32A
דיודת לייזר	אופטוטק	סיב במצב יחיד 780 ננומטר - LD מצומד
סיב אופטי	תורלאבס	780 כ"ס
מד הספק	קוהרנטית	בדיקת לייזר
ImageJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי	מכשירי אקסון	ImageX-press 5000A
PBS
צלחת פוליסטירן 96 באר
CO2
T75 צלוחיות