יצירת תרביות תאי גנגליון רשתית ראשוניים מעוברי דגי זברה

תקציר

מקור: Terzi, A., et al., ROS Live Cell Imaging במהלך התפתחות עצבית. J. Vis. Exp. (2021)

הסרטון מדגים שיטה לגידול תאי גנגליון רשתית ראשוניים מעוברי דגי זברה. עוברים בשלב מוקדם עוברים דיסקציה כדי לבודד את העיניים, אשר לאחר מכן מנותקים מכנית לתוך השעיה של תאי גנגליון הרשתית. תרחיף תאים זה מתורבת על גבי כיסויים המצופים בחלבוני דבק כדי להקל על התפתחות האקסון.

פרוטוקול

1. הכנת פתרונות

1. מדיית E2 (1x)
   1. הכן פתרונות 100x E2A (500 מ"ל), 500x E2B (100 מ"ל) ו- 500x E2C (100 מ"ל) על-ידי שילוב כל הרכיבים המוצגים בטבלה 1. פתרונות Autoclave E2A, E2B ו- E2C. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
   2. עבור מדיה אחת מסוג E2: שלב 5 מ"ל של 100x E2A, 1 מ"ל של 500x E2B ו-1 מ"ל של 500x E2C. מביאים את הנפח ל 500 מ"ל עם מים סטריליים. התאם את ה- pH ל- 7.0-7.5.
   3. הכינו 50 מ"ל aliquots של מדיה 1x E2 ואחסנו ב -20 °C לאחסון לטווח ארוך. עם זאת, משקעים יכולים להתרחש עם הפשרה. ודא שהמשקעים מומסים במלואם לפני השימוש בתמיסת המלאי.

טבלה 1: רכיבים של מדיה 1x E2 עבור תרבית תאים של דגי זברה.

תמיסה	רכיב	כמות	ריכוז
100X E2A (500 מ"ל)
	NaCl	43.8 גרם	1500 מ"מ
	KCl	1.88 גרם	50 מ"מ
	מגסו4	6 גרם	100 מ"מ
	KH2PO4	1.03 גרם	15 מ"מ
	נא2HPO4	0.34 גרם	5 מ"מ
500X E2B (100 מ"ל)
	CaCl2	5.5 גרם	500 מ"מ
500X E2C (100 מ"ל)
	NaHCO3	3 גרם	350 מ"מ
1X E2 (500 מ"ל)
	100X E2A	5 מ"ל	פי 1
	500X E2B	1 מ"ל	פי 1
	500X E2C	1 מ"ל	פי 1

2. מדיה E3 (1x)
   1. המס את הרכיבים במים סטריליים בנפח 1 ליטר כפי שמוצג בטבלה 2 כדי ליצור מלאי פי 100. לדלל את המלאי במים סטריליים כדי ליצור מדיה 1x E3.
   2. הוסיפו 0.2% מתילן כחול. לקבלת 20 מ"ל של מדיה E3 1x, הוסף 40 μL של מתילן כחול.

טבלה 2: רכיבים של מדיה 100x E3 לשמירה על עוברים של דגי זברה.

רכיב	סכום (גרם)	ריכוז במלאי 100X (mM)
NaCl	29.22	500
KCl	1.26	17
CaCl2 2H2O	4.85	33
MgSO4 7H2O	8.13	33

3. 80x תמיסת מלאי מלוחים
   1. שלב את כל הרכיבים המוצגים בטבלה 3. מוסיפים מים להכנת תמיסה של 100 מ"ל. מערבבים עד שכל הרכיבים מומסים. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.

טבלה 3: רכיבים של תמיסת מלח 80x עבור מדיה של תרבית תאים של דגי זברה.

רכיב	סכום (גרם)	ריכוז במלאי (mM)
גלוקוז	1.44	80
נתרן פירובט	0.44	40
CaCl2 2H2O	0.148	10
HEPES	6.1	256

4. מדיום תרבית תאי דג זברה (ZFCM+)
   1. שלב את כל הרכיבים המוצגים בטבלה 4 ליצירת מדיה של 250 מ"ל. התאם את ה- pH ל- 7.5. סנן מדיה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ואחסן ב- 4 ° C.

טבלה 4: מרכיבים של תרבית תאי דג זברה עם סרום ואנטיביוטיקה.

רכיב	כמות (מ"ל)	% נפח
L-15 בינוני (עם פנול אדום)	212.75	85.1
סרום בקר עוברי (FBS)	5	2
פניצילין/סטרפטומיצין	1	0.4
תמיסת מלח 80X	3.125	1.25
מים	28.125	11.25

2. תרבית תאי גנגליון רשתית ראשונית שמקורה בעוברים של דגי זברה

הערה: בצע שלבים 2.1 ו- 2.2 במכסה מנוע של זרימה למינרית.

1. הכנת כיסויים
   1. הכינו 4-6 צלחות תרבית בכל ניסוי. יש להשתמש בכיסויים מנוקים בחומצה (22 x 22 מ"מ מרובעים; עובי 0.16-0.19 מ"מ) המאוחסנים באתנול 100%.
   2. הסר מכסה אחד ממיכל האחסון באמצעות מלקחיים והבעיר אותו כדי להסיר שאריות אתנול.
   3. יבשו את הכיסוי באוויר לחלוטין על ידי הנחתו בזווית בתוך צלחת תרבית בקוטר 35 מ"מ.
   4. הכינו תמיסת עבודה פולי-די-ליזין (PDL) (1x) על ידי דילול ציר פי 10 (5 מ"ג/מ"ל) במים סטריליים.
   5. יש למרוח 100 μL של 0.5 מ"ג/מ"ל PDL על מרכז כל כיסוי ולהימנע מהתפשטות התמיסה לקצוות.
   6. יש לדגור על ה-PDL על כיסויים למשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). ודא שה- PDL אינו מתייבש.
   7. לשטוף את PDL עם 0.5 מ"ל מים סטריליים שלוש פעמים. תנו לצלחות להתייבש לחלוטין.
   8. הכן פתרון עבודה למינין (1x) על ידי דילול מלאי 50x (1 מ"ג / מ"ל) ב 1x PBS.
   9. יש למרוח 100 μL של 20 מיקרוגרם/מ"ל למינין ב-PBS על מרכז כל כיסוי ולהימנע מהתפשטות התמיסה לקצוות.
   10. יש לדגור על הצלחות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח למשך 2-6 שעות. הימנעו מייבוש תמיסת הלמינין.
2. דיסקציה של עוברים וציפוי RGCs
   1. הכינו ותייגו ארבע צלחות תרבית רקמה בקוטר 35 מ"מ ומלאו ב-4 מ"ל של: 70% אתנול, "E2 מדיה 1", "E2 מדיה 2", "E2 מדיה 3" ביום הנתיחה. שומרים את הכלים במקרר עד לנתיחות.
   2. כאשר עוברים של דגי זברה נמצאים 34 שעות לאחר ההפריה (hpf), הוציאו את כלי התרבית המצופים בלמינין מהאינקובטור ושטפו את הכיסויים שלוש פעמים עם 0.5 מ"ל של PBS 1x.
   3. לאחר השטיפה הסופית, הוסיפו 4 מ"ל של חומרי הדפסה ZFCM(+) לכל צלחת תרבית והימנעו מייבוש הצלחת.
   4. אחזר את מנות התרבות המוכנות משלב 2.2.1. תנו להם לאזן ל-RT.
   5. מלא 4-6 צינורות PCR עם 15 μL של מדיה ZFCM(+). יש צורך בצינור אחד כדי להכין RGCs מ-4 עיניים כדי להיות מצופים על מכסה אחד.
   6. יש להוציא עוברים מדגי זברה מהאינקובטור ולטבול עוברים בצלחת תרבית רקמה בקוטר 35 מ"מ המכילה 70% אתנול למשך 5-10 שניות לעיקור.
   7. באמצעות פיפטת העברה, מעבירים עוברים לצלחת E2 Media 1 המכילה מדיה סטרילית E2 לשטיפת עודפי אתנול.
   8. העבירו את העוברים לצלוחית E2 Media 2 והסירו את הכוריון שלהם בעזרת מלקחיים חדים.
   9. העברת עוברים לצלחת E2 Media 3 סופית לביצוע דיסקציות.
   10. בעזרת זוג מלקחיים עדינים, נתחו את הרשתיות.
   11. מקמו והחזיקו את העוברים קדמיים לחלמון שלהם עם אחד המלקחיים והסירו את אחורי הזנב לשק החלמון עם המלקחיים האחרים.
   12. תפסו את הצוואר במלקחיים והורידו את הראש כדי לחשוף את המוח והעיניים לתקשורת E2. הימנעו מחיתוך שק החלמון.
   13. עם קצה המלקחיים העדינים, גלגלו בעדינות את העיניים מהראש, תוך החזקת רקמת הגולגולת למטה עם המלקחיים השניים. יש לבודד את העיניים מפסולת הרקמה הסמוכה.
   14. העבירו ארבע עיניים לאחד הצינורות שהוכנו מראש המכילים ZFCM(+).
   15. הטיטר בעדינות למעלה ולמטה עם פיפטת P20 וקצה צהוב בערך 45 פעמים כדי לנתק תאים. הימנעו מבועות אוויר.
   16. העבר את ZFCM(+) עם תאים מנותקים למרכז הכיסוי. חזור על שלבים 10-12 לקבלת כיסויים נוספים.
   17. יש לשמור על תרביות על ספסל בטמפרטורה של 22°C על מדף קצף פוליסטירן כדי לספוג רעידות.
   18. יש לבצע הדמיה 6-24 שעות לאחר הציפוי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבית 35 מ"מ	זארשטדט	83-3900
סידן כלורי דיהידראט	פישר סיינטיפיק	C79-500
כיסוי זכוכית	קורנינג	2850-22
כלי פטרי חד פעמיים (100 x 15 מ"מ)	VWR	25384-094
סרום בקר עוברי	תרמופישר סיינטיפיק	26140087
גלוקוז	סיגמא אלדיץ'	G7528
HEPES	סיגמא אלדיץ'	H4034
למינין	תרמופישר סיינטיפיק	23017-015
L-15 בינוני של לייבוביץ' ללא פנול אדום	גיבקו/פישר סיינטיפיק	21-083-027
PBS	Hyclone/פישר סיינטיפיק	SH3025601
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמופישר סיינטיפיק	15140122
פולי-די-ליזין (PDL)	סיגמא אלדיץ'	P7280
נתרן פירובט	סיגמא אלדיץ'	P5280
מסנן סטריטופ 0.22 מיקרומטר	מיליפור	S2GPT05RE