יצירת תאי עצב מתאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בדם

תקציר

מקור: Becker-Kojić, Z. A., et al. דור ללא GM של תאי עצב שמקורם בדם. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת תאים עצביים מתאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בדם (BD-PSCs). BD-PSCs מתקבלים באמצעות תכנות מחדש של תאי אב בדם. ה-BD-PSCs הבלתי ממוינים מגודלים בתרבית על גבי כיסויים מצופים מצע של תרבית תאים באמצעות מדיום אינדוקציה עצבית ומדיום התמיינות עצבי, מה שגורם להתמיינות לתאים עם פנוטיפ עצבי.

פרוטוקול

אישורים אתיים התקבלו בעת ביצוע הניסויים.

1. בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMNCs)

1. ודא שכל התורמים חתמו על הסכמה מדעת לפני נטילת הדם בהתאם להנחיות המוסדיות.
2. קח 30 מ"ל דם מתורמים בריאים על ידי צוות רפואי מיומן על פי הפרוטוקול הסטנדרטי.
3. בודד PBMNCs על-ידי מדיה הדרגתית של צפיפות. השתמש 10 מ"ל של מדיה עם 25 מ"ל של דם 1: 1 מדולל עם מלוחים חוצץ פוספט (PBS), וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 30 דקות.
4. בודד את שכבת הביניים בין הפלזמה לבין מדיית שיפוע הצפיפות על ידי פיפטציה. שטפו את התאים המבודדים עם 5 מ"ל של PBS סטרילי וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות. חזור על הפעולה פעמיים.
5. ספור את מספר התאים בשיטות סטנדרטיות באמצעות תא ספירה.

2. הפעלה של גליקופרוטאין מעוגן גליקוזילפוספטידילינוזיטול אנושי (GPI) על ידי הצלבת נוגדנים על פני השטח של PBMNCs

1. מקם את 6 x 10⁶ תאים חד-גרעיניים (MNCs) בצינורות של 15 מ"ל ובצע הצלבת נוגדנים על ידי דגירה של התאים עם נוגדן ספציפי לחלבון ממברנה מקושר GPI אנושי (30 מיקרוגרם / מ"ל) למשך 30 דקות ב- PBS עם אלבומין בסרום בקר 1% (BSA) ב- 37 ° C.
2. החלף את מדיום הדגירה בתווך דולבקו המותאם של איסקוב בתוספת סרום בקר עוברי 10% (FBS).
3. לגדל תאים בצינורות פוליסטירן 15 מ"ל, לשים את הצינורות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 8-10 ימים (ללא רעידות). ביום 5 (D5), הוסף 1-2 מ"ל נוספים של המדיום של Iscove בתוספת 10% FBS לכל צינור 15 מ"ל.

3. מיון של תאים חדשים שנוצרו dedifferentiated

1. ספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי (תרחיף תאים של 18 μL + צבע פלואורסצנטי של 2 μL) או בתא ספירה.
2. תרחיף תאים בתרבית צנטריפוגה (5-7 x 10⁶) ב 300 x גרם במשך 10 דקות ושאפו את supernatant שנוצר עם פיפטה סטרילית פסטר.
3. יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-90 μL של PBS pH 7.2 מקורר מראש, 0.5% BSA ו-2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
4. הוסף CD45 חרוזים מגנטיים חיוביים בגודל ננו (80 μL) לתרחיף התא ודגור על קרח במשך 15 דקות.
5. שטפו את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ PBS וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות.
6. להשהות מחדש את התאים ב 500 μL של מאגר PBS.
7. שטפו את העמוד עם 500 μL של מאגר PBS מקורר מראש והניחו אותו בשדה המגנטי.
8. הניחו את מתלה התא על העמוד ושטפו אותו עם 500 μL של חיץ PBS (פעמיים) וזרימת הצנטריפוגה המכילה תאים שליליים CD45. לאסוף אותם בתווך של Iscove בתוספת 1% BSA.
9. ספור את התאים בתא הספירה.

4. הכנת צלחות תרבית תאים להתמיינות עצבית של תאי גזע חדשים שנוצרו

1. מצפים את כלי התרבית עם poly-L-ornithine ו laminin עבור תאים עצביים גדלים.
2. הניחו את כיסויי הזכוכית בצלחות בנות 4 בארות וציפו אותן בפולי-L-אורניתין מדולל ביחס 1:5 (0.1 מ"ג/מ"ל במים מזוקקים כפול [ddH₂O]) ב-ddH₂O. הכניסו את הכיסויים לאינקובטור של 37°C למשך שעה אחת. לאחר מכן לשטוף עם ddH₂O.
3. הפשירו למינין באיטיות (0.5-2.0 מ"ג/מ"ל) והוסיפו לחלק העליון של הכיסויים. לדגור אותו ב 37 ° C במשך 2 שעות.
4. הכינו מדיום אינדוקציה עצבי N2 המורכב מ-49 מ"ל של תערובת ה-Eagle medium/nutrient של Dulbecco F-12 (D-MEM/F12), 500 μL של תוסף N2, 400 μL של חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), תמיסת גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (FGF) בריכוז סופי של 20 ng/mL (מוכן מתמיסת מלאי של 100 מיקרוגרם/מ"ל), והפרין בריכוז סופי של 2 ng/mL.
5. הסר את עודפי הלמינין על ידי פיפטציה והוסף מדיום עצבי N2 לצלחות תרבית.

5. תרבית תאי דם עצביים לא ממוינים

1. תרבית תאים שליליים CD45 שמקורם ב- BD על זכוכית מצופה למינין / אורניתין מכסים במשך יומיים באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO₂ בתווך N2 כדי ליזום התמיינות עצבית של תאים חדשים שנוצרו BD.
2. תאי תרבית נוספים במדיום התמיינות עצבי המורכב מ 48 מ"ל של תווך נוירובזאלי, 500 מיקרוליטר של L-גלוטמין, 1 מ"ל של תוסף B27, 500 μL של NEAA, 50 μL של גורם נוירוטרופי רקומביננטי אנושי נגזר גליה (GDNF) ב 5 מיקרוגרם / 250 μL ב PBS / 0.1% BSA, ו 50 μL של גורם נוירוטרופי רקומביננטי המוח האנושי (BDNF) ב 5 מיקרוגרם / 200 μL ב PBS / 0.1% BSA ו 50 μL של תמיסת חומצה אסקורבית 2.9 גרם / 50 מ"ל ב- PBS. מניחים את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אלבומין חלק V	רוט	T8444.4
ערכת כדאיות תא AO/PI	ביואנזים	872045	הביוזים הופסק. המוצר מיוצר על ידי לוגוס ביוסיסטמס.
חומצה אסקורבית 2-פוספט sequimagnes	סיגמא אולדריץ'	A8960-5G
סרום B27 ללא 50x	פישר סיינטיפיק (Gibco)	11530536
פתרון FGF בסיסי	פישר סיינטיפיק (Gibco)	10647225
ביוקול	מרק מיליפור	L6115-BC	צפיפות מדיה הדרגתית
BSA Frac V 7.5%	גיבקו	15260037
CD45 MicroBeads	מילטני	130-045-801	חרוזים מגנטיים בגודל ננומטרי
שקופיות ספירת תאים לונה	ביואנזים	872010	הביוזים הופסק. המוצר מיוצר על ידי לוגוס ביוסיסטמס.
D-MEM/F12	מרק מיליפור	FG4815-BC
פ.ב.ס.	מרק מיליפור	S0115/1030B	הופסק. זמין תחת: TMS-013-B
GDNF רקומביננטי אנושי	פישר סיינטיפיק (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	גיבקו	35050038	ל-גלוטמין
תא נתרן הפרין	סיגמא-אולדריץ'	H3149-50KU
BDNF אנושי	פישר סיינטיפיק (Gibco)	11588836
איסקוב (IMDM)	ביוכרום	FG0465
עכבר למינין	פישר סיינטיפיק (Gibco)	10267092
מונה תאים אוטומטי Luna FL	ביואנזים	872040	הביוזים הופסק. המוצר מיוצר על ידי לוגוס ביוסיסטמס.
מאגר MACS	מילטני	130-091-221
MEM NEAA 100x	גיבקו	11140035
MiniMACS Trennsäulen	מילטני	130-042-201
מולטיפלאט נונקלון 4 בארות	פישר סיינטיפיק	10507591
תוסף N2 100x	פישר סיינטיפיק (Gibco)	11520536
מדיום נוירובזלי	גיבקו	10888022
PBS סטרילי	רוט	9143.2
פולי-L-אורניתין	סיגמא-אולדריץ'	P4957-50ML