גדילה והתמיינות של נוירונים בעלי ננו-חלקיקים מגנטיים על פלטפורמות מגנטיות

תקציר

מקור: Indech, G., et al. ייצור פלטפורמות מגנטיות לארגון בקנה מידה מיקרוני של נוירונים מחוברים. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים את ספיגת החלקיקים המגנטיים הפלואורסצנטיים (MNPs) על ידי תאי העצב באמצעות אנדוציטוזה. גידול תאי עצב אלה העמוסים ב-MNP על המצע בעל התבנית המגנטית מאפשר את ההתקשרות של התאים. הוספת גורם גדילה המכיל תווך מסייעת לצמיחת שלוחות נוירונים, בעוד שהשדה המגנטי של המצע מכוון את כיוון ההרחבה.

פרוטוקול

1. קליטת ננו-חלקיקים מגנטיים תאיים (MNP)

1. הכינו מדיום גדילה בסיסי לתרבית תאי PC12 על ידי הוספת 10% סרום סוסים (HS), סרום בקר עוברי 5% (FBS), 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-0.2% אמפוטריצין למדיום של המכון הרפואי רוזוול פארק (RPMI), וסננו באמצעות מסנן ניילון של 0.22 מיקרומטר.
2. יש להוסיף 1% סרום סוסים (HS), 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-0.2% אמפוטריצין ל-RPMI בינוני כדי להכין מדיום בידול PC12 ולסנן באמצעות מסנן ניילון 0.22 מיקרומטר.
3. לגדל תאים בבקבוק תרבית לא מטופל עם 10 מ"ל של מדיום גידול בסיסי; להוסיף 10 מ"ל של מדיום גידול בסיסי לבקבוק כל 2-3 ימים, ותת תרבית התאים לאחר 8 ימים.
4. לקליטה תאית, צנטריפוגו את תרחיף התא בצינור צנטריפוגה למשך 8 דקות בטמפרטורה של 200 × גרם ובטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנט.
5. להשעות את התאים ב 3 מ"ל של מדיום גידול בסיסי טרי. שוב, צנטריפוגו את מתלה התא למשך 5 דקות בטמפרטורה של 200 × גרם ובטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנט. להשעות את התאים ב 3 מ"ל של מדיום התמיינות טרי.
6. שאפו את התאים פי 10 באמצעות מזרק ומחט כדי לפרק אשכולות תאים. לספור את התאים באמצעות המוציטומטר, ולזרוע 10⁶ תאים בצלחת רגילה לא מצופה 35 מ"מ.
7. הוסף לצלחת את הנפח המחושב של השעיית MNP ואת נפח מדיום ההבחנה כדי להשיג את ריכוז ה- MNP הרצוי ואת הנפח הכולל. מערבבים את התאים, ה-MNPs ואמצעי ההתמיינות; לדגור את המנה באינקובטור לח 5% CO₂ ב 37 ° C במשך 24 שעות.
8. צנטריפוגו את מתלה התא למשך 5 דקות ב-200 × גרם בטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנט. להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מדיום התמיינות טרי, ולספור את התאים באמצעות המוציטומטר.

2. התמיינות תאים וגדילה על פלטפורמה מגנטית

1. נקו את המצע המעוצב עם 70% v/v/ אתנול והניחו את המצע בכלי תרבית 35 מ"מ במכסה המנוע. הניחו מגנט גדול (~1500 אורסטד) מתחת למצע המעוצב למשך דקה אחת והוציאו את המגנט על ידי הזזת הצלחת תחילה למעלה והרחק מהמגנט, ולאחר מכן הוציאו את המגנט ממכסה המנוע. הפעל את האור האולטרה סגול למשך 15 דקות.
2. מצפים את המצע בקולגן מסוג 1 על ידי דילול קולגן מסוג 1 (תמיסה מזנב חולדה) בקנ"מ 1:50 באתנול V/V 30%. לציפוי צלחת 35 מ"מ, הוסיפו 20 מיקרוליטר קולגן ל-1 מ"ל של 30% אתנול.
3. מכסים את התבשיל בתמיסה, ומחכים עד שכל התמיסה מתאדה, ומשאירים את התבשיל חשוף למשך מספר שעות. לשטוף 3x סטרילי 1x PBS; מגלשת הזכוכית מוכנה לזריעת תאים.
4. להשהות את התאים לאחר ספיגת MNP תאי, זרעו 10⁵ תאים בצלחת תרבית 35 מ"מ, והוסיפו 2 מ"ל של מדיום התמיינות. לדגור את התרבית ב 5% CO2, אינקובטור לחות ב 37 ° C.
5. לאחר 24 שעות, יש להוסיף 1:100 מורין טרי β-NGF (ריכוז סופי של 50 ננוגרם/מ"ל). מחדשים את מדיום הבידול ומוסיפים מורין טרי β-NGF כל יומיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבית תאים 6 בארות	בז	353846
צלחת תרבית תאים 96 בארות	SPL מדעי החיים	30096
פתרון אמפוטריצין B	תעשיות ביולוגיות	03-028-1B
אלבומין בסרום בקר (BSA)	תעשיות ביולוגיות	03-010-1B
בקבוק תרבות תאים ורקמות	ביופיל	TCF002250	75.0 ס"מ^2 250 מ"ל מכסה אוורור, לא מטופל
צלחת תרבית תאים	גריינר ביו-וואן	627-160	35 מ " מ
צינור צנטריפוגה	ביופיל	CFT021500	50 מ"ל
קולגן סוג I	קורנינג בע"מ	354236	זנב חולדה, טווח ריכוז 3-4 מ"ג/מ"ל
מחט חד פעמית	KDL		23 גרם
מזרק חד פעמי	מדיספו	1160227640	10 מ"ל
נסיוב סוס תורם	תעשיות ביולוגיות	04-124-1א
אתנול 70%	רומיקאל בע"מ	19-009102-80
אתנול מוחלט (מיובש)	ביו-מעבדה כימית	52505
סרום בקר עוברי (FBS)	תעשיות ביולוגיות	04-127-1א
מורין טרי β-NGF	פפרוטק	450-34
אלקטרומגנט GMW C-frame .	באקלי מערכות בע"מ		3470, 45 מ"מ
ל-גלוטמין	תעשיות ביולוגיות	03-020-1B
PBS 10x	HYLABS	BP507/1LD
קו תאי PC12	ATCC	CRL-1721
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין ניסטטין	תעשיות ביולוגיות	03-032-1B
RPMI 1640 עם L-גלוטמין	תעשיות ביולוגיות	01-100-1א