$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת תאי גזע עובריים אנושיים (hESC)-מוסמכים צלחות מצופות ממברנת מרתף
- הפשירו באיטיות את תמיסת ממברנת המרתף בעלת אישור hESC (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C למשך 2-3 שעות לפחות או למשך הלילה, כדי למנוע היווצרות של ג'ל.
- להכנת לוחות מטריצת ממברנת מרתף, מדללים מטריצה בתווך הנשר המותאם של דולבקו קר עם F12 (DMEM+F12) לריכוז סופי של 2%. מערבבים היטב ומצפים כל באר של צלחת 6 באר עם 1 מ"ל של פתרון מטריצה מדולל.
- יש לדגור על הלוחות המצופים בממברנה במרתף בטמפרטורת החדר (RT) למשך 3 שעות לפחות או ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: צלחות עם מטריצת קרום מרתף ניתן לאחסן ב 4 ° C במשך שבוע 1 לפני פתרון מטריצה מוסר לוחות משמשים.
2. התאמה של תאי גזע עובריים מסוג מושבה לתרבית hESC של תא בודד
- כדי לעבור את התרביות נטולות ההזנה של תאי גזע עובריים מסוג H9 (WA09) שגדלו על מטריצת קרום המרתף, שאפו את התווך מהבארות (איור 1A).
- יש לשטוף 1x עם 1 מ"ל של DPBS. הוסף 1 מ"ל של תמיסת dispase (1 U / mL) לכל באר ודגור ב 37 ° C במשך 20 דקות.
- הסר את הדף, שטוף את התאים 1x בעדינות עם 2 מ"ל של DMEM/F12, להסיר את המדיום, ולהוסיף 2 מ"ל של DMEM/F12 לכל צלחת.
- יש לנתק בעדינות מושבות על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה ולהעביר לצינור בנפח 15 מ"ל.
- צנטריפוגו את הכדוריות למשך 2 דקות ב 370 x גרם ושאפו את המדיום.
- כדי לנתק את כדורי התא לתאים בודדים, יש להוסיף 2 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים (ריכוז 1x, ראו טבלת חומרים) ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות.
- תאי צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 370 x גרם ולהסיר את תמיסת הניתוק.
- הוסף תווך ESC אנושי mTeSR1 טרי ונתק את התאים לתאים בודדים על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה.
- כדי להתאים תאי גזע עובריים מסוג מושבה לתרבית מסוג תא יחיד, לוחו בערך 1.5–2.0 x 106 hESCs לתוך כל באר של צלחת 6 בארות מצופות מטריצת קרום מרתף ב-2 מ"ל של mTeSR1 המכילה מעכב ROCK של 10 מיקרומטר למשך 24 שעות (איור 1A).
- לאחר 24 שעות, החלף את תווך ה-hESC ב-mTeSR1 טרי ללא מעכב ROCK ואפשר לתאי הגזע העובריים לגדול כסוג של תא בודד למשך 3 ימים. שנה את המדיום מדי יום.
- ביום הרביעי, כאשר התרביות מגיעות לכמעט 100% מפגש, יש לנתק תאים בתמיסת ניתוק, ואז לצלחת מחדש כמתואר בשלב 2.6.
הערה: מעכב ROCK משפר את הישרדות התאים במהלך 24 השעות הראשונות של תרבית תאי גזע עובריים מסוג תא יחיד.
3. התמיינות של תאי גזע עובריים מסוג תא בודד ל-NPCs (איור 2)
- כדי לגרום להתמיינות NPC, נתק תאי גזע עובריים מסוג תא בודד עם 1 מ"ל של תמיסת ניתוק (1x) ודגור במשך 10 דקות ב- 37 ° C.
- צנטריפוגו את התאים למשך 2 דקות ב 370 x גרם ולהסיר את פתרון ניתוק supernatant. הוסף 1 מ"ל DMEM/F12 והשהה מחדש תאים על ידי פיפטינג עדין.
- תאי צלחת על פלטת 6 בארות מצופות ממברנת מרתף בצפיפות של 2 x 105 תאים/באר ב-2 מ"ל של mTeSR1 המכילים מעכב ROCK של 10 מיקרומטר.
- לאחר 24 שעות, החלף את מדיום התרבית במדיום אינדוקציה עצבי (DMEM עם 1% B27 פחות ויטמין A) בתוספת 1 מיקרומטר dorsomorphin ו 5 μM SB431542.
- שנו את המדיום כל יומיים במהלך 4 הימים הראשונים של האינדוקציה העצבית, ואז כל יום עד שתגיעו למפגש ביום 7 (איור 2B).
הערה: (1) דורסומורפין מעכב את מסלול BMP על ידי התמקדות בקולטני ALK2,3,6 וגם מעכב AMPK; SB431542 הוא מעכב של מסלול TGFβ/Activin על ידי התמקדות ALK5,7. (2) אותו פרוטוקול נבדק עם קו ESC אחר (WA01), שהניב תוצאות דומות ל-WA09. (3) בדרך כלל השתמשנו במטריג'ל למטריצת קרום המרתף; אולם ניתן לגדל תאים בתרבית על גלטרקס ואז להתמיין ל-NPC עם תוצאות דומות מאוד, כפי שמצוין על-ידי ביטוי של כמה סמני NPC (איור 3D, E). טפל בגלטרקס באותו אופן כמו מטריג'ל (ראה סעיף 1).
