הכנת תרביות פרוסות צפות ממוח אנושי בוגר

תקציר

מקור: Fernandes, A., et al. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים טכניקה להכנת תרביות פרוסות צפות בחופשיות מהמוח האנושי הבוגר. פרוסות דקות נוצרות מאזור במוח באמצעות ויברטום. פרוסות אלה תלויות לאחר מכן במדיום תרבית בתוספת גורמי גדילה כדי לשמור על כדאיות הרקמה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. עיקור חומרים

הערה: יש לעקר את כל החומרים והתמיסות לפני השימוש.

1. יש לעקר את כל כלי הניתוח וחומר חיתוך הוויברטומים (מחזיק סכין, דיסק דגימה, מגש חיץ) בתנור חיטוי יבש למשך 4 שעות בטמפרטורה של 180°C.
2. עיקור חומר או ציוד רגיש לטמפרטורה על ידי קרינת UV או גמא.
3. עיקור מדיה ותמיסות על ידי אוטוקלאבציה או סינון דרך קרומי נקבוביות 0.22 מיקרומטר.

2. הכנת פתרונות

1. הכן 15-20 מ"ל של תמיסת הובלה: 50% v/v תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) pH 7.4, 50% v/v מדיום בסיסי לתחזוקה של נוירונים במוח לאחר לידה ובוגרים (טבלה של חומרים), בתוספת 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 3 מ"ג / מ"ל גלוקוז, ו 33 מיקרוגרם / מ"ל gentamicin.
   הערה: פתרון ההובלה חייב להיות מקורר ומחומצן (מבעבע בגז קרבוגן) לפחות 20 דקות לפני איסוף הדגימה.
2. הכינו 300 מ"ל של תמיסת חיתוך (HBSS בתוספת 10 mM HEPES ו-3 מ"ג/מ"ל גלוקוז) וקררו אותה במקפיא עד לנקודת היווצרות הגביש הראשונית.
3. הכינו 20 מ"ל של מדיום תרבית: מדיום בסיסי לתחזוקה של נוירוני מוח לאחר לידה ומבוגרים (טבלה של חומרים) בתוספת 1% נגזרת L-גלוטמין (טבלה של חומרים), 2% תוספת לתרבית עצבית (טבלה של חומרים), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ו 0.25 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין B.

3. הגדרת מנגנון החיתוך

הערה: פרוטוקול זה מבוצע באופן אידיאלי בסיוע עמית בשל הלוגיסטיקה של איסוף הדגימות בחדר הניתוח.

1. בדלי של קרח בתוספת מלח, הניחו לתמיסת החיתוך לנוח תחת תערובת קרבוגן מבעבעת (95% O₂, 5% CO₂) במשך 20 דקות לפחות לפני השימוש.
2. הכינו גוש של 3% אגרוז (בערך 2 ס"מ x 2 ס"מ x 2 ס"מ) והדביקו אותו על דיסק דגימת הוויברטום כדי ליצור תמיכה מכנית נוספת לדגימת הרקמה במהלך החיתוך (איור 1E).
3. הגדר את הוויברטומה לחיתוך: עובי חתך של 200 מיקרומטר, תדירות רטט של 100 הרץ ומהירות חיתוך בין 0.5-1.0 מ"מ לשנייה.
4. נעלו את מגש חיץ הוויברטום לבסיס הוויברטום והוסיפו קרח כדי לשמור אותו בקירור לפני קבלת תמיסת החיתוך והדגימה, ולאורך כל הליך החיתוך.

4. אוסף דוגמאות

הערה: בפרוטוקול זה, רקמה ניאוקורטיקלית אנושית נאספה בחדר הניתוח והועברה למעבדה.

זהירות: בעת התמודדות עם דגימות אנושיות, פעל בהתאם לפרוטוקולי הבטיחות המתאימים שנקבעו על ידי המכון.

1. הגדר את מנגנון ההובלה (איור 1C) המורכב מ: בלון גז נייד עם תערובת קרבוגן המחובר לשסתום לחץ/שטף השולט על תפוקת הגז המחובר לצינור סיליקון המחבר את יציאת הגז לכלי ההובלה; כלי הובלה, בדרך כלל צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל עם מכסה מחורר לכניסת גז, המכיל את פתרון התחבורה; וקרח לקירור דגימה במהלך ההובלה.
2. אספו והעבירו את הדגימה (איור 1B) מיד למעבדה. לטבול את הדגימה בתמיסת הובלה קרה (כל הזמן מבעבע עם תערובת קרבוגן).

5. חיתוך

1. העבירו את הדגימה לצלחת פטרי (100 מ"מ x 20 מ"מ) המכילה תמיסת חיתוך, ובעזרת כלי ניתוח עדינים הסירו בזהירות כמה שיותר מקרומי המוח שנותרו בדגימה (איור 1D).
2. בחר את כיוון הדגימה הטוב ביותר לייצור פרוסות עם המאפיינים הספציפיים של העיצוב הניסיוני, ועם להב אזמל מס '24, חתוך משטח שטוח כדי להיות הבסיס המודבק לדיסק הדגימה.
3. בעזרת כף פלסטיק חד פעמית ומברשות צבע עדינות, אוספים את השבר מצלחת הפטרי ומייבשים את עודפי התמיסה בעזרת נייר פילטר (מייבשים בנימים ונמנעים מלגעת בשבר הרקמה בנייר).
4. באמצעות דבק-על, חברו את הרקמה לדיסק דגימת הוויברטומה עד שהיא נצמדת היטב לדיסק ובמגע עם גוש האגרוז (איור 1E).
5. הניחו את דיסק דגימת הוויברטום (עם רקמה מחוברת כראוי) במגש חיץ הוויברטומה המלא בתמיסת חיתוך שחייבת להיות מבעבעת במהלך כל התהליך.
6. נעל את מחזיק הסכין במקומו כאשר סכין הגילוח קבועה היטב.
7. תמיסת החיתוך חייבת לכסות גם את הדגימה וגם את הלהב, ורק אז להתחיל לחתוך (איור 1F).
8. חותכים את הדגימה לפרוסות של 200 מיקרומטר.
   הערה: למרות שחלק מהוויברטומים חותכים את הדגימות באופן אוטומטי, התצפית הצמודה וההתאמות הקלות במהירות החיתוך במהלך התהליך עשויות לסייע בהפקת פרוסות טובות יותר. השליכו פרוסות ראשוניות לא סדירות.
9. מעבירים את הפרוסות ממגש החיץ לצלחת פטרי עם תמיסת חיתוך וחותכים קצוות רופפים ועודפי מאטר לבן ליחס של כ-70% קליפת המוח/30% חומר לבן.

6. תרבות

הערה: בצע שלב זה בארון זרימה למינרית בסביבה סטרילית.

1. מוסיפים 600 מיקרוליטר תרבית בינונית לבאר (בצלחת של 24 בארות) ודגרים לפחות 20 דקות בטמפרטורה של 36°C ו-5% CO₂ לפני ציפוי הפרוסות.
2. מקציפים פרוסה אחת לכל באר בעזרת מברשת צבע (איור 1G).
3. אם יש בארות שאינן בשימוש בצלחת, למלא אותם עם 400 μL של מים סטריליים.
4. לדגור על הצלחת ב 36 ° C, 5% CO₂.
   הערה: החלפה בינונית ראשונה חייבת להיעשות בין 8-16 שעות לאחר הציפוי, תלוי בגודל הפרוסה.
5. תוספת 10 מ"ל של מדיום התרבית שהוכן בעבר עם 50 ng/mL מוח נגזר גורם נוירוטרופי (BDNF).
   הערה: במהלך 8-16 השעות הראשונות, הפרוסות מודגרות ב 600 μL של מדיום כדי למנוע חסך תזונתי והחמצה, שכן הצריכה הבינונית בשלב זה מואצת. מן השלב הבא, נפח בינוני לכל באר מותאם ל 400 μL.
6. הסר 333 μL של המדיום המותנה מכל באר והוסף 133 μL של מדיום טרי בתוספת BDNF.
7. חזור על תהליך ההחלפה הבינונית כל 24 שעות על ידי החלפת שליש מהתווך המותנה בתווך טרי בתוספת BDNF.

תוצאות

איור 1: איסוף דגימות, הובלה, חיתוך וטיפוח של רקמת קליפת המוח מבני אדם בוגרים. ההליך מתחיל בחדר הניתוח עם איסוף רקמת קליפת המוח מכריתת האונה הרקתית לטיפול באפילפסיה עמידה פרמקו-עמיד (A,B). (C) מקטע רקמה (n = 1) מועבר מיד לצינור המכיל אמצעי הובלה מחומצן קר כקרח (ראה להלן). (D) במעבדה מסירים את קרומי המוח באמצעות פינצטה אופתלמית עדינה. עודפי נוזלים מיובשים באמצעות נייר פילטר, והשבר מודבק (E) לדיסק דגימת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז	סיגמא אולדריץ'	A9539
אמוניום פרסולפט	סיגמא	A3678-25G
אמפוטריצין ב	גיבקו	15290-018
B27	גיבקו	17504-044
BDNF	סיגמא אולדריץ'	SRP3014
אלבומין בסרום בקר	סיגמא אולדריץ'	A7906
גלוקוז	מרק	108337
גלוטמקס	גיבקו	35050-061
המלחים המאוזנים של האנק	סיגמא אולדריץ'	H1387-10X1L
Hepes	סיגמא אולדריץ'	H4034
נוירובזל A	גיבקו	10888-022
PBS Buffer pH 7.2	לבורקלין	590338
פניצילין/סטרפטומיצין	סיגמא אולדריץ'	עמ' 4333
ציוד וחומרים
תערובת קרבוגן	ווייט מרטינס		95% O2, 5% CO2
חממת CO2	ניו ברנזוויק סיינטיפיק	קו-24	דגירה של פרוסות 5% CO2, 36ºC
כף פלסטיק			גודל כף קינוח
סכין גילוח	ביק		Chrome Platinum, המשמש לחיתוך עם ויברטום
להב אזמל	בקטון דיקינסון (BD)	מספר 24	משמש לחיתוך רקמות; מומלץ באותו גודל או קטן יותר
דבק-על (Loctite Super Bonder)	הנקל		הרכב: Etilcianoacrilato; 2-חומצה פרופנואית; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; הומופולימר
ויברטומה	לייקה	14047235612 - VT1000S