כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכינו צלחת פטרי עבור CD11b Immunopanning (יום 0)
הערה: הכינו מנה אחת של אימונופנינג לכל מוח של 1-2 חולדות צעירות.
- הוסף 25 מ"ל של תמיסת 50 מ"מ Tris pH 9.5 לצלחת פטרי בקוטר 15 ס"מ.
- הוסיפו לצלחת IgG נגד עכבר (שרשראות H+L) נגד עכברים לקבלת ריכוז סופי של 6 מיקרוגרם/מ"ל. מערבלים את הצלחת לפיזור שווה.
- לדגור את המנה במשך 1 - 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
- יש לשטוף כלים שלוש פעמים עם DPBS++ (מלח חוצץ פוספט (PBS) עם Ca2+ ו-Mg2+), ולאחר מכן להחליף בתמיסה של מאגר פנורמי המכיל נוגדן OX42 של 1 מיקרוגרם/מ"ל. השאירו את הכלים למשך הלילה בטמפרטורת החדר על משטח שטוח.
2. איסוף רקמות (יום 1)
הערה: פרוטוקול זה אמור להימשך ~3 - 4 שעות.
- לפני שמתחילים, ודאו שכל הפתרונות סטריליים וצוננים על קרח. מצננים את כל המכשירים על קרח ומעקרים עם אתנול לפני השימוש.
- בהתאם לנהלים רגולטוריים מתאימים, להקריב חולדת מעבדה צעירה על ידי חנק פחמן דו חמצני.
הערה: לחלופין, ניתן להקריב בעלי חיים צעירים יותר עם מנה קטלנית של קטמין/קסילזין (100 - 200 מיקרוליטר של 24 מ"ג/מ"ל קטמין, 2.4 מ"ג/מ"ל קסילזין). יש להשתמש בקטמין/קסילזין אם בעלי חיים הם מתחת לגיל 14 יום. אם אתם משתמשים במספר בעלי חיים, חלצו את הרקמה מחיה אחת והניחו אותה ב-DPBS++ מקורר מראש על קרח לפני שתמשיכו לחיות הבאות.
- צבטו כף אחורית והבטיחו חוסר תגובה מוחלט מהחיה לפני שתמשיכו.
- לנקב את בעל החיים עם 10 - 30 מ"ל של חיץ זילוח קר כקרח באמצעות מחט 271/2-G עד החיץ פועל ברור.
הערה: נפח חיץ הזילוח ישתנה בהתאם לגודל/גיל החיה.
- מיד לאחר זילוח להסיר את הראש של החיה. מגיע מחוט השדרה לחתוך את הקונדיל העורפי מכל צד עם מספריים דיסקציה, להיזהר לא לפגוע במוח. לאחר חיתוך כל צד בזהירות, חותכים צד אחד לאורך העצם הקודקודית והקדמית לכיוון עצם האף. בעזרת מלקחיים משכו בזהירות לאחור את החלק העליון של הגולגולת, הסירו במהירות את המוח (או את מבני מערכת העצבים המרכזית המעניינים אתכם), והניחו אותם ב-DPBS++ מקורר מראש על קרח.
- חזור על הפעולה עבור כל בעלי החיים הנותרים.
הערה: כל שלבי ההליך צריכים להתבצע במכסה מנוע זרימה למינרי בתנאים סטריליים נאותים.
3. דיסוציאציה מכנית (יום 1)
- לאחר שכל המוחות נאספו, חתכו מוח אחד ל-1 מ"מ3 גושים בצלחת פטרי על קרח עם להב אזמל קר, והעבירו להומוגנייזר מקפץ קר כקרח עם חיץ 5-7 מ"ל קר כקרח. נתקו מוח אחד בכל פעם.
- נתק את הרקמה באמצעות 10 - 20 משיכות עדינות ולא שלמות עם הומוגנייזר קופץ רופף. יש להקפיד לא למחוץ ישירות את הרקמה בתחתית ההומוגנייזר, אלא לדחוף את הרקמה דרך החלל שבין צידי הבוכנה לבין ההומוגנייזר.
- בזהירות להסיר את הבוכנה כדי למנוע החדרה של בועות אוויר. מאפשרים לגושי רקמה מנותקים היטב לשקוע לתחתית ההומוגנייזר, ומעבירים סופרנאטנט לצינור חרוטי חדש ומצונן של 50 מ"ל.
- החלף את עוצמת הקול שהוסרה במאגר ניקוי טרי, וחזור על שלבים 3.2 ו- 3.3 בסך הכל 3 - 4 סיבובים, או עד שכל הרקמה נותקה. חזור על התהליך עבור כל מוח.
4. הסרת מיאלין (יום 1)
הערה: הסרת מיאלין משמשת לבידוד תאי מיקרוגליה מבעלי חיים מעל P12.
- מדוד את נפח תרחיף התא בצינור החרוטי של 50 מ"ל באמצעות פיפטה של 25 מ"ל, ולאחר מכן הוסף חיץ ניקוי קר כקרח כדי להתאים את הנפח הכולל ל- 33.5 מ"ל.
- הוסף 10 מ"ל של חיץ הפרדת מיאלין (MSB) לתרחיף התא וערבב היטב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. התוצאה תהיה ריכוז סופי של 23% של MSB בנפח של 43.5 מ"ל.
- תאי צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-500 x גרם ב-4°C עם בלימה איטית.
הערה: הצנטריפוגה אמורה לקחת בערך 1.5 - 2 דקות כדי להאט. זה ייצור שכבה עליונה של מיאלין ופסולת תאים מתים, סופרנאטנט עכור במקצת, וגלולה קטנה יותר המועשרת לתאים חיים.
- מוציאים את השכבה העליונה של המיאלין/פסולת ואת הסופרנאטנט בעזרת פיפטה. היזהר בעת הסרת השכבה העליונה כדי להבטיח שכמה שיותר ממנה יוסרו.
- השהה מחדש את גלולת התא ב- 12 מ"ל של מאגר גלילה. שלשו בעדינות את תרחיף התא כדי לפרק גושי תאים שעלולים להישאר.
5. אימונופנינג (יום 1)
- העבירו את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר פסולת גדולה או גושי תאים.
- שטפו שלוש פעמים את תבנית הגלילה המצופה בציפוי OX42 עם DPBS++ . אל תתנו לצלחת להתייבש לחלוטין בין השטיפות.
- יוצקים את שטיפת DPBS++ האחרונה והחילו את מתלה התאים המסונן על צלחת הגלילה. סובבו בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התאים, ולאחר מכן דגרו על הצלחת על משטח שטוח בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לאפשר לתאים להידבק. אין לדגור יותר מ -20 דקות, אחרת התאים יתקשו מאוד להתאושש מהמנה.
- שטפו את תבנית הגלילה עם DPBS++ 10 פעמים כדי להסיר תאים שאינם נדבקים. מיקרוגליה תהיה מחוברת היטב לצלחת, לכן מערבלים את הצלחת עם כל שטיפה כדי להבטיח הסרה של תאים אחרים שאינם נדבקים.
- שפכו את הכביסה האחרונה של DPBS++ והחליפו ב-15 מ"ל DPBS++ ו-200 מיקרוליטר טריפסין (1.25% תמיסת מלאי).
- לדגור על המנה במשך ≤10 דקות ב 37 ° C עם 10% CO2 כדי trypsinize.
הערה: אין להמשיך יותר מ -10 דקות, אחרת יהיה קשה להסיר מיקרוגליה.
- לאחר 10 דקות של טריפסיניזציה, מיקרוגליה עדיין יהיה דבוק לצלחת. יש לשפוך טריפסין/DPBS++ ולשטוף בעדינות 2x עם DPBS++ כדי להסיר טריפסין, להחליף ב-12 מ"ל של מדיום גידול מיקרוגליה קר כקרח (MGM).
- הניחו את תבנית הגלילה על קרח למשך 2 דקות כדי לעזור להחליש את האינטראקציה בין התא למצע, וודאו שהכלי שטוח כדי למנוע התייבשות אזורים בצלחת הגלילה.
- פיפטה במרץ עם פיפטה 10 מ"ל בקר פיפט במהירות גבוהה כדי לשחזר תאים מן צלחת גלילה. צייר רשת 16 x 16 עם זרם הנוזל מן פיפטה כדי לנסות להסיר את כל התאים.
- בדוק תאים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 20 כדי לוודא שהתאים התנתקו מהצלחת. סמנו כתמים על גבי הצלחת שבהם התאים עדיין תקועים, וחזרו על הפיפטינג באזורים אלה.
- לאסוף תא השעיה aliquot 3 - 4 מ"ל של supernatant לכל 15-מ"ל צינור חרוט. סחרור במשך 15 דקות ב- 500 x g ב- 4 ° C עם בלימה איטית.
הערה: טוויית מיקרוגליה דרך נפח קטן מאפשרת התאוששות מקסימלית של תאים.
- שואפים את supernatant, משאיר 0.5 מ"ל של MGM עם גלולת התא.
- השהה מחדש כל גלולה ב- MGM שנותר, ואיחד את התאים מכל הצינורות.
- לספור תאים עם המוציטומטר.
- תאי לוחית כמתואר בשלבים 6 - 7, בהתאם ליישום.
- תאי תרבית ב 37 ° C עם 10% CO2.
הערה: תאים יכולים להיות בתרבית עד 3 - 4 שבועות עם שינויי מדיה קבועים או שבוע אחד ללא שינויי מדיה.
6. ציפוי נקודתי צלחות תרבית רקמה / כיסויים (יום 1)
- צלחת 15 μL של ציפוי קולגן IV ישירות במרכז צלחת תרבית רקמה מצופה אניונית/קטיונית 24 בארות (ראה טבלת חומרים לפרטים) ודגרה במשך 15 דקות ב 37 ° C עם 10% CO2.
- לאחר ספירת תאים עם hemocytometer לדלל תאים ל 2.3 x 105/מ"ל ב MGM. לשאוף קולגן IV נקודה מיד צלחת 15 μL של השעיית התא למקום זה; זה ייתן 3.5 x 103 תאים / נקודה. יש לדגור במשך 5-10 דקות ב-37°C עם 10%CO2 כדי לאפשר לתאים להידבק, להוסיף 500 μL של TGF-β2/IL-34/כולסטרול שווה ערך CO2 המכיל מדיום גדילה (TIC) בעדינות לבאר.