מאמר שיטה

הכנת מקטעי מוח בשיטת התאוששות הגנה מבוססת NMDG

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Ting, J. T. et al. הכנת פרוסות מוח חריפות באמצעות שיטת התאוששות ממוטבת N-מתיל-D-גלואמין. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון וידאו זה מתאר פרוטוקול להשגת פרוסות מוח באמצעות שיטת התאוששות הגנה מבוססת N-מתיל-D-גלוקמין (NMDG). מוח מנותח מודגר ב-aCSF עם NMDG ו-HEPES כדי למזער מוות ונזק של תאים עצביים במהלך החיתוך. הקטע רשאי להתאושש ב- aCSF כדי לשחזר את הפעילות הסלולרית

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. דיסקציה וחיתוך מוח

  1. ערפו את ראשה של החיה. השתמש אזמל כדי לפתוח את העור על הראש ולחשוף את כובע הגולגולת.
  2. השתמשו במספריים עדינים בחיתוך מעולה כדי לחתוך את העור מעל כובע הגולגולת ולבצע חתכים קטנים לרוחב משני הצדדים בבסיס הקאודלי/גחוני של הגולגולת. בצע חתכים רדודים נוספים החל מהאספקט הקאודלי/גבי של הגולגולת, נע בכיוון הרוסטרלי במעלה קו האמצע הגבי תוך הקפדה שלא לפגוע במוח הבסיסי. בצע חיתוך 'T' סופי בניצב לקו האמצע בגובה נורות הריח.
    הערה: יש להקפיד על כך שלא ייגרם נזק לאזורי המוח המעניינים. בפרט, בשום שלב לא צריך להיות כל כוח דחיסה מופעל על המוח עצמו.
  3. השתמשו במלקחיים בעלי החוד העגול כדי לתפוס את הגולגולת, החל מהאספקט הרוסטרלי-מדיאלי והתקלפו חזרה לכיוון הקאודלי-לטרלי. חזור על הפעולה כדי ששני הצדדים ייפתחו ויסירו את החצי הגבי של כובע הגולגולת כדי לחשוף את המוח. גרפו בעדינות את המוח השלם לתוך של NMDG-HEPES aCSF מקורר מראש. אפשרו למוח להתקרר באופן אחיד במשך ~1 דקה.
  4. השתמשו במרית הגדולה כדי להרים את המוח מהכוס אל צלחת הפטרי המכוסה בנייר פילטר. חותכים וחוסמים את המוח בהתאם לזווית החיתוך המועדפת ולאזור העניין הרצוי במוח. עבוד במהירות כדי למנוע מחסור ממושך בחמצן במהלך הטיפול.
    הערה: זוויות חיתוך רבות אפשריות. שיטת החסימה המדויקת וזווית החיתוך יהיו תלויות באזור המוח המדויק, בסוג התא ובמעגל שייחקר.
  5. הדביקו את בלוק המוח למחזיק הדגימה באמצעות דבק דבק. משכו את החתיכה הפנימית של מחזיק הדגימה מספיק כדי למשוך את גוש המוח במלואו פנימה. יוצקים את האגרוז המותך ישירות לתוך המחזיק עד שגוש המוח מכוסה במלואו באגרוז. הדקו את גוש הקירור של האביזר המקורר מראש סביב מחזיק הדגימה למשך ~10 שניות עד שהאגרוז יתמצק.
  6. הכנס את מחזיק הדגימה לכלי הקיבול במכשיר כלי הפריסה וודא את היישור הנכון. מלאו את המאגר בשאריות NMDG-HEPES aCSF מקורר מראש ומחומצן מהכוס של 250 מ"ל והעבירו אבן בועות לתוך המאגר למשך החיתוך כדי להבטיח חמצון הולם.
  7. כוונן את המיקרומטר כדי להתחיל לקדם את דגימת המוח המשובצת באגרוז. הפעל את כלי הפריסה והתאם אמפירית את מהירות ההתקדמות ותדירות התנודה לרמה הרצויה.
    הערה: שתי ההגדרות צריכות להיות בטווח הנמוך. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, מעבר יחיד של זרוע הלהב צריך לקחת בערך 20 שניות והתנודה צריכה לייצר רעש זמזום חלק ועדין מאוד ללא זמזום גלוי.
  8. המשך להתקדם ולפרוס את הרקמה במרווחים של 300 מיקרומטר (או עובי מועדף אחר) עד שאזור העניין במוח מחולק במלואו; הזמן הכולל להליך החיתוך צריך להיות פחות מ -15 דקות.

2. הליך שחזור מגן NMDG ממוטב

  1. שלב התאוששות NMDG ראשוני (שלב קריטי): עם השלמת הליך החיתוך, אספו את כל הפרוסות באמצעות פיפטת פסטר מפלסטיק חתוך והעבירו אותן לתא התאוששות ראשוני שחומם מראש (34°C) מלא ב-150 מ"ל של NMDG-HEPES aCSF. מעבירים את כל הפרוסות ברצף קצר ומפעילים טיימר ברגע שכל הפרוסות מועברות לתא ההתאוששות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קומפרסטום VF-200מכשירים מדויקיםVF-200כלי פריסה רוטט של רקמות (מומלץ)
N-מתיל-D-גלוקמיןסיגמא אולדריץ'M2004aCSF - מרכיבי
נתרן כלוריסיגמא אולדריץ'S3014aCSF - מרכיבי
אשלגן כלוריסיגמא אולדריץ'P5405aCSF - מרכיבי
נתרן פוספט מונובייסיק דיהידראטסיגמא אולדריץ'71505aCSF - מרכיבי
סודיום ביקרבונטסיגמא אולדריץ'S5761aCSF - מרכיבי
HEPESסיגמא אולדריץ'H4034aCSF - מרכיבי
גלוקוזסיגמא אולדריץ'G7021aCSF - מרכיבי
נתרן אסקורבטסיגמא אולדריץ'A4034aCSF - מרכיבי
טיוראהסיגמא אולדריץ'T8656aCSF - מרכיבי
נתרן פירובטסיגמא אולדריץ'P5280aCSF - מרכיבי
סידן כלורי דיהידראטסיגמא אולדריץ'C7902aCSF - מרכיבי
מגנזיום סולפט heptahydrateסיגמא אולדריץ'M1880aCSF - מרכיבי
מלקחיים קהים מעוקליםכלים מדעיים משובחים11065-07כלי דיסקציה מוחית
מספריים לניתוח עדין (חיתוך על)כלים מדעיים משובחים14058-09כלי דיסקציה מוחית
מספריים גדולים וכבדים בגודל 7 אינץ'כלים מדעיים משובחים14000-18כלי דיסקציה מוחית
מרית מתכתסיגמא אולדריץ'Z511455-1PAKכלי דיסקציה מוחית
סכיני גילוחVWR89031-954כלי דיסקציה מוחית
שומר פרוסת המוח-4אוטומציה מדעיתS-BSK4תא אחיזה של פרוסת מוח
רשת ניילוןוורנר אינסטרומנטס64-0198לבניית תאי שחזור פרוסות קטנות
כוסות זכוכית Pyrex (250 מ"ל)VWR89090-434לבניית תאי שחזור פרוסות קטנות
צלחת פלסטיק 35 מ"מ, עגולהVWR100488-376לבניית תאי שחזור פרוסות קטנות
אבני מפזר גז (10 מיקרומטר)סיגמא אולדריץ'59277לקרבוגנציה קבועה (בועות עדינות)
סוג אגרוז I-Bסיגמא אולדריץ'A0576להטמעת דגימות מוח
חומצה הידרוכלוריתסיגמא אולדריץ'H1758-100MLלהתאמת pH של מדיה
נתרן הידרוקסידיסיגמא אולדריץ'221465-25Gלהתאמת pH של מדיה
אשלגן הידרוקסידסיגמא אולדריץ'221473להתאמת pH של מדיה
פייפטים העברת פלסטיק 3 מ"ל בוגרVWR89497-676להעברת פרוסות
להבי מזרק קרמי זירקוניוםלהבים מיוחדים לקצב הדיוושEF-INZ10http://cadenceinc.com/
אמבט מים מחוממים (2.5 ליטר)VWR13491-060שונות
סינון סבבי ניירVWR28456-022שונות
דבק ציאנואקרילטאמזוןB000BQRBO6שונות
צלחת פטרי מזכוכיתVWR89000-326שונות
10X פוספט מלח חוצץסיגמא אולדריץ'P5493שונות
תרמומיקסר (עם בלוק צינור של 1.5 מ"לVWR89232-908כדי לשמור על אגרוז מותך
המדד המדד המדד המדד המדד המדד המדד המדד המדד המדד המדד המדד )

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NMDG HEPES aCSFBrain SectioningAcute Brain SlicesProtective Recovery MethodArtificial Cerebrospinal FluidAgarose EmbeddingVibratome SlicingSlice Recovery ChamberNeuronal Cell ViabilityElectrophysiological Properties

מאמרים קשורים