מאמר שיטה

טכניקה לדגירת רקמה עצבית ממושכת של הרשתית

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Cameron, M. A., et al. דגירה ממושכת של רקמה עצבית חריפה לאלקטרופיזיולוגיה והדמיית סידן. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים שיטה לדגירת רקמה עצבית ממושכת ברשתית. משקפיים המכילים רשתית מתקבלים מעין עכבר; הקרום המגביל הפנימי (ILM) מתעכל אנזימטית כדי לחשוף את התאים העצביים של הרשתית, וכוס העין המטופלת או הרשתית המבודדת מועברת לאינקובטור מיוחד לדגירת ממושך בטמפרטורה נמוכה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנת רשתית מלאה והסרת קרום מגביל פנימי

  1. הכינו את הרכבי הרשתית בתנאי תאורת מעבדה רגילים או באור אדום/אינפרא אדום עמום.
  2. הרדימו בעלי חיים על ידי נקע צוואר הרחם ומיד לחנך את העיניים. יש לבצע חתך קטן לאורך האורה-סרטה, ולהניח במדיה של איימס, או בנוזל מוחי מלאכותי (aCSF) המכיל (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 גלוקוז, 0.5 L-גלוטמין, ולהרוות בקרבוגן (95% O2/5% תערובת CO2; ~300 mOsm; pH 7.4), בטמפרטורת החדר (RT).
  3. יש להסיר מיד את הקרנית, העדשה והזגוגית על ידי חיתוך לאורך האורטה עם מספריים קטנים והסרת העדשה והזגוגית בעזרת מלקחיים. מקם רקמה במערכת הדגירה בכתובת RT.
    הערה: רקמת הרשתית יכולה להישמר בעין, לאחר הורדת טמפרטורה איטית ל 15 - 16 מעלות צלזיוס, במשך >24 שעות במערכת הדגירה עד לצורך.
  4. כדי להסיר את ה-ILM, העבירו את המשקפיים המכילים את הרשתית לצנצנת זכוכית קטנה המכילה 30 U/mL פפאין, 1 mM L-ציסטין, 0.5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ו-0.005% deoxyribonuclease (DNase) בתמיסת מלח מאוזנת של ארל (BSS) ב-37°C למשך 20 דקות. יש למרוח 95% O2/5% CO2 על התמיסה דרך המכסה, אך אין לבעבע. אם משתמשים ברקמה מבעלי חיים צעירים (<6 שבועות), לדלל את הפתרון לחצי כוח.
    1. עצור עיכול אנזימטי על ידי הנחת הרקמה בתמיסת אובומוקואיד (10 מ"ג / מ"ל) וסרום בקר אלבומין (BSA, 10 מ"ג / מ"ל) למשך 10 דקות ב- BSS של ארל. לשטוף רקמות ביסודיות עם aCSF לפני המעבר למערכת הדגירה ולהפחית את הטמפרטורה ל 15 - 16 מעלות צלזיוס.
  5. יש לשמור על רקמת הרשתית בעין עד לצורך. להעברה למיקרוסקופ, בודדו את הרשתית מהעין וחתכו ל -4 חתיכות עם סכין גילוח. אם הרשתית כולה נדרשת, בצע ארבעה חתכים קטנים בשולי הרשתית כדי לאפשר לה לשכב שטוחה.
    הערה: לניסויי הדמיה, יש להעמיס עם צבעי סידן לפני העברתם למערכת הדגירה, ראו להלן.

2. שמירה על רקמה באינקובטור

  1. הניחו רקמה בתא הראשי המכילה בדיקות למדידות pH וטמפרטורה (איור 1A, B).
  2. יש להזרים aCSF דרך תא שני (תא UVC, שנבנה כפי שתואר קודם לכן) שבודד מהתא הראשי וחשוף לאור אולטרה סגול C (UVC) של 1.1W (254 ננומטר, מנורת UV מעקרת 5W/2P) כדי לחסל חיידקים שצפים בתמיסה (איור 1A). שלוט בתזמון אור UVC באמצעות טיימר הניתן לתכנות באמצעות תכונה אקראית המופעלת בזמנים המשתנים בין 15 ל -26 דקות כל 15 - 30 דקות כדי למנוע חימום מוגזם של aCSF.
  3. הגדר את קצב הזרימה בתא UVC ל- 12 מ"ל / דקה כפי שדווח בעבר. כסו את תא UVC ברדיד אלומיניום כדי למנוע תאורת UVC מחוץ לתא, מה שעלול לפגוע ברקמה העצבית.
    הערה: עבור רקמת רשתית מותאמת כהה, יש למרוח כיסוי מותאם אישית על החדר הראשי כדי למנוע אור.
  4. השתמש במשאבה פריסטלטית כדי להפיץ את התמיסה (aCSF) דרך שני התאים ובמצנן פלטה קרה תרמואלקטרי של פלטייה כדי לקרר או לחמם את התא הראשי לטמפרטורות הרצויות בטווח של 0 - 50 מעלות צלזיוס. לדגירה אופטימלית של רקמות, יש להשתמש ב-15 - 16 מעלות צלזיוס לכדאיות ארוכת טווח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1. מערכת דגירה המאפשרת ויסות הדוק של סביבת הרקמות. A, תרשים סכמטי של מערכת הדגירה המורכבת מלוח פלטייה קירור, תא ראשי, משאבה פריסטלטית ותא UVC. B, מבט צדדי על החדר הראשי המציג את נקודות הכניסה והיציאה של aCSF, כמו גם את כניסת הקרבוגן, הטמפרטורה ובדיקות ה- pH. הרקמה ממוקמת על הרשת כפי שצוין. כל בדיקות המדידה מחוברות למכסה כדי לאפשר יציבות מבנית. חותמת פרמטרים C, a...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נתרן כלוריסיגמא אולדריץ' VETECV800372
אשלגן כלוריסיגמא אולדריץ'עמ' 9333
N-מתיל-D-גלוקמיןסיגמא אולדריץ'M2004
D-גלוקוזסיגמא אולדריץ'G5767
סודיום ביקרבונטסיגמא אולדריץ'S6014
מגנזיום כלוריסיגמא אולדריץ'M9272
סידן כלוריסיגמא אולדריץ'223506
מערכת דיסוציאציה פפאיןוורטינגטוןLK003150
מיקרוסקופ זקוף שלב קבועאולימפוסBX51WI
מטרת המיקרוסקופאולימפוסXLUMPlanFLN 20x/1.00Wפי 20
מטרת המיקרוסקופאולימפוסLUMPlanFLN 60x/1.00Wפי 60
Braincubatorפאיו סיינטיפיקBR26021976www.braincubator.com.au
מצנן פלטות קר פלטה תרמואלקטרית פלטה פלטהטכנולוגיית TECP-121
בקר טמפרטורהטכנולוגיית TETC-36-25 RS232

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PeltierAmesWhole Mount

מאמרים קשורים