בידוד וטיפוח של תאי גזע עצביים בוגרים מהאזור התת-קלוסלי של העכבר

תקציר

מקור: Kim, J. Y., et al. בידוד ותרבית של תאי גזע עצביים בוגרים מאזור התת-קלוסלי של העכבר. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון מדגים את תהליך הבידוד והטיפוח של תאי גזע עצביים מהאזור התת-קלוסלי של מוח העכבר. זה כרוך בניתוח רקמות, דיסוציאציה אנזימטית, וטיפוח אותם עם גורמי התמיינות כדי להתפתח לתאים עצביים בוגרים.

פרוטוקול

1. הכנת חומרים ומדיום תרבות

1. עבור דיסקציה ודיסוציאציה של SCZ (אזור Subcallosal), לעטוף את מטריצת המוח, סכין גילוח פיפיות, מלקחיים עם רדיד אלומיניום, ולאחר מכן לעקר אותם על ידי autoclaving.
2. הכינו 50 מ"ל של חיץ PBS קר (מלח חוצץ פוספט) כדי לשטוף את כל מוח העכבר.
3. הקימו מיקרוסקופ דיסקציה והכינו את הכלים הכירורגיים הדרושים לנתיחת המוח (מספריים ומלקחיים אוטוקלאביים) ולבידוד ה-SCZ (מזרק 1 מ"ל, מחט 30 גרם, מטריצת מוח ומלקחיים עדינים).
4. הכנת מדיום N2:
   1. הכינו F-12/DMEM (+L-גלוטמין, +סודיום ביקרבונט) בינוני עם 2% B27, 1% תוספי N2 ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
      הערה: מדיום הגידול מורכב מגורמי גדילה בינוניים N2 (20 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי מטוהר (EGF) ו-20 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF2)).
5. הכינו חיץ עיכול (40 יחידות/מ"ל פפאין, 2.4 יחידות/מ"ל dispase II ו-2% פניצילין-סטרפטומיצין ב-PBS) לעיכול רקמות.
6. הכנת פלטת ציפוי וכיסוי:
   1. הכינו פולי-L-אורניתין (אש"ף; 0.01%) ולמינין (10 מיקרוגרם/מ"ל מומס ב-DH₂O). כדי לצפות צלחות 6 בארות לתחזוקת SCZ-aNSCs (תאי גזע עצביים בוגרים) כשכבה חד-שכבתית או ככיסויים בקוטר 18 מ"מ לצביעת חיסון, יש לדגור עליהם עם אש"ף למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו אותם 3 פעמים עם DH₂O. הניחו לצלחות ולכיסויים להתייבש לאחר הכביסה האחרונה.
   2. לאחר מכן, לדגור את הצלחות עם למינין לילה ב 4 °C (75 °F). לאחר מכן, שטפו אותם 3 פעמים עם DH₂O.
      אזהרה: אין לייבש את הלמינין, דבר שישפיע על חיבור התא.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בתמיסות הציפוי 3 פעמים.

2. בידוד ודיסוציאציה של SCZ מבוגר

1. לפני הכנת התרבית, הניחו את מטריצת המוח ואת סכין הגילוח הדו-צדדי על ice.
   הערה: אל תקפיאו את מטריצת המוח, מכיוון שהמוח עלול להיצמד אליה.
2. להקריב עכבר (בן 8 שבועות) על ידי חנק CO₂ או נקע צוואר הרחם.
   1. חותכים את הראש במספריים חדים לאחר ריסוס 70% אתנול. כדי לשתק את הראש, החזיקו את שני צידי הראש בחוזקה. חותכים את העור עם מספריים בקו האמצע בכיוון קאודלי-רוסטרלי. זה מקדם הסרה מלאה של העור מן הגולגולת.
   2. הסר תחילה את החלק הקאודלי של הגולגולת (אחורי ללמדא) ולאחר מכן הכנס את המלקחיים בין הגולגולת למוח במיקום קו האמצע הגבי. תפסו את העצם הקודקודית השמאלית (או הימנית) וקילפו אותה בזהירות. חזור על הליך זה להסרת העצם הקודקודית השנייה.
      הערה: ניתוק עצב הראייה והסרת קרומי המוח מהמוח מקלים על ניתוק המוח מהגולגולת.
   3. העבירו את המוח למאגר PBS קר (25 מ"ל) ושטפו אותו פעמיים כדי להסיר עודפי דם.
3. הכניסו את המוח למטריצת המוח על קרח ובצעו חתכים בעטרה כדי לקבל פרוסות בעובי 1 מ"מ. העבירו את פרוסות המוח (1 מ"מ) המכילות את אזורי SCZ הממוקמים בחלק האחורי של המוח ל-PBS קר בצלחת פטרי פלסטיק 35 מ"מ.
   זהירות: על מנת לקבל מישור מקביל של קטעי העטרה, ודא כי הסדק במוח ממוקם בקו האמצע של מטריצת המוח; חשוב להימנע משינויים מיותרים בסעיפים.
   הערה: להשיג פרוסות מוח ב 2-3 מ"מ אחורי כדי bregma; זה מאפשר את ההפרדה של SCZ מן SVZ (אזור subventricular).
4. תחת המיקרוסקופ המנתח עם הגדלה נמוכה, חתכו במיקרו את ה-SCZ מאזור החומר הלבן בקליפת המוח ובהיפוקמפוס בעזרת מחט 30G כפופה6,9. לאחר מכן, הסר את אזורי קליפת המוח שמעל ל-SCZ. מניחים את אזור SCZ החתוך מהפרוסות לתוך צלחת פטרי פלסטיק 35 מ"מ על קרח ללא PBS.
   קר הערה: זיהום של אזורים נוספים המכילים נוירונים בוגרים יכול להשפיע על הכדאיות של aNSCs והיווצרות נוירוספרה מאחר שהם עוברים מוות תאי בתנאי תרבית aNSC.
5. באמצעות מחט 30 גרם כפופה, מיד לקצוץ את הרקמות מנותחות לחתיכות קטנות.
   הערה: אם נדרש זמן רב יותר לניתוח רקמת SCZ, לטבול את הרקמות המנותחות ב- PBS קר לפני החיתוך.
6. להשעות מחדש את הרקמה הקצוצה עם 1 מ"ל של חיץ העיכול, להעביר את הרקמה לצינור 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של חיץ העיכול, ולדגור אותו במשך 30 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: נערו את הצינור כל 10 דקות כדי לערבב היטב.

3. תרבית תאי גזע עצביים בוגרים נגזרים מאזור תת-קלוסלי

1. הקש על הצינור בעדינות כדי לנתק את הרקמה המעוכלת, ולאחר מכן צנטריפוגה את הצינור ב 145 x גרם במשך 5 דקות. להשליך את supernatant, להשהות מחדש את הרקמה מעוכל עם 1 מ"ל של מדיום N2 שחומם מראש כדי לשטוף את חיץ העיכול, בעדינות מזלפים את פתרון הדגימה מקסימום של 5 פעמים באמצעות פיפטה P1000.
   הערה: טריטוציה מוגזמת עם קצה צינור צר עלולה לפגוע בכדאיות התא ובגדילה שלאחר מכן.
2. צנטריפוגה את הצינור ב 145 x גרם במשך 5 דקות. לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את כדור התא ב 1 מ"ל של מדיום N2.
3. מכינים 1 מ"ל של מדיום N2 בצלחת 6 באר לא מצופה ומוסיפים 1 מ"ל של התאים התלויים כדי ליצור נפח סופי של 2 מ"ל.
4. הוסיפו EGF (20 נ"ג/מ"ל) ו-bFGF (20 נ"ג/מ"ל) לכל באר. נערו בעדינות את צלחת התרבית בת 6 הבארות ביד כדי לערבב את גורמי הגדילה הנוספים עם התאים המצופים. שמרו את צלחת 6 הקידוחים באינקובטור של 37°C ו-5%_CO2.
5. יש להוסיף EGF (20 נ"ג/מ"ל) ו-bFGF (20 נ"ג/מ"ל) לכל באר מדי יום למשך 8 ימים. כל יום שלישי, להוסיף 200 μl של מדיה N2 כדי לשמור על נפח משוער 2 מ"ל של המדיום.

4. העברת תאי גזע עצביים כנוירוספרות ולתרביות חד-שכבתיות

1. לאסוף את neurospheres ולהעביר אותם צינור חרוטי חדש 15 מ"ל.
   הערה: מספר הנוירוספרות (>50 מיקרומטר) לבאר מה-SCZ של מוח עכבר יחיד היה 64.3 ±-7.31, שהיה פחות מזה של SVZ (190.5 ±-6.33).
2. דגרו על הנוירוספרות עם 0.5 מ"ל של חיץ דיסוציאציה למשך 5 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את הנוירוספרות לתאים בודדים. נוירוספרות ראשוניות יכולות להיות מנותקות לתאים בודדים ומתוחזקות על פני מספר מעברים כנוירוספרות או תרביות חד-שכבתיות.
   הערה: הרחבת SCZ-aNSCs כשכבה אחת עדיפה על נוירוספרות מכיוון שניתן לעבור SCZ-aNSCs >10 פעמים בתבנית תרבית חד-שכבתית אך <5 פעמים בתבנית תרבות נוירוספרית.
   זהירות: SCZ-aNSCs מפגינים צבירה חזקה, וקשה לנתק אותם לתאים בודדים. לפיכך, פורמט תרבית נוירוספרה אינו מומלץ להרחבת תאים שגרתית.
3. צינור בעדינות את תמיסת הדגימה למעלה ולמטה עם פיפטה P1000 פחות מ 5 פעמים וצנטריפוגה את הצינור ב 145 x גרם במשך 5 דקות. להשליך את supernatant ו להשעות מחדש את neurospheres עם 1 מ"ל של N2 medium.
   הערה: קשירת יתר עם קצה פיפטה צר עלולה לפגוע בכדאיות התא ובגדילה שלאחר מכן.
4. כדי לספור את התאים, הכינו תערובת של 1:1 של תרחיף התא (10 מיקרוליטר) ותמיסת טריפאן כחול 0.4%, ולאחר מכן ספרו את מספר התאים החיים על המטוציטומטר. לאחר ציפוי צלחת 6 בארות עם אש"ף/למינין, לוחצים את התאים בגודל 2.5 x 105 תאים/מ"ל עם 2 מ"ל מדיום N2 לכל באר.
   הערה: שינויים בצפיפות התאים יכולים להשפיע על מצבם ועל פוטנציאל ההתמיינות שלהם.
5. שמור על SCZ-aNSCs עם טיפול יומי של גורמי גדילה (2 מ"ל, 20 ng / ml) במשך 5 ימים, ולאחר מכן לעבור אותם.

5. התמיינות של תאי גזע עצביים בוגרים שמקורם ב-Subcallosal Zone

1. לוחית aNSCs על כיסוי 18 מ"מ מצופה אש"ף/למינין עם 1 x 105 תאים/מ"ל ב-1 מ"ל N2 עם גורמי גדילה (20 נ"ג/מ"ל) להתמיינות של SCZ-aNSCs.
2. למחרת, כאשר התאים מחוברים היטב לכיסוי, החליפו את מצע הגידול ב-N2 כדי להסיר את גורמי הגדילה.
3. לאחר 6 ימים, לשטוף את התאים ממוינים עם 1 מ"ל של PBS כדי להסיר פסולת תאים לתקן אותם עבור immunostaining.
   הערה: BrdU יכול להיות משולב לתוך DNA מסונתז חדש של תאים מתרבים. לכן, אם תרצה, BrdU (10 מיקרוגרם / מ"ל) ניתן להוסיף תאים חיים לפני קיבוע של תאים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM/F12	גיבקו	11320-033	L-גלוטמין, סודיום ביקרבונט
עט/סטרפ	Invitrogen	15140-122
תוספת N2	גיבקו	17502-048
תוסף B27	גיבקו	17504-044
bFGF	מו"פ	233-FB
EGF	גיבקו	PHG0313
PBS (פי 10)	ביו-פתרון	BP007a	דילול פי 1
HBSS	גיבקו	14175-095
דיספאס השני	רוש	04-942-078-001
פפאין	וורטינגטון	3126
אקוטאזה	תקשוב	AT-104
מלקחיים עדינים	WPI	555229ו
מספריים	סטורץ	E3321-C
מטריצת מוח (1 מ"מ)	RWD	68707
סכין גילוח פיפיות	דורקו	ST-300
מחט 30 גייג'	סונגשים	N1300
15 מ"ל צינורות	SPL	50015
50 מ"ל צינורות	SPL	50050
צלחת 35 מ"מ	SPL	10035	פטרידיש
צלחת 100 מ"מ	SPL	10090	פטרידיש
החלקת כיסוי (18 מ"מ)	דקגלייזר	111580
12 מנה טובה	SPL	32012	ללא ציפוי
6 מנות באר	SPL	32006	ללא ציפוי
אש"ף	סיגמא	עמ' 4957	0.01%
למינין	גיבקו	23017-015	10 מ"ג/מ"ל
נסטין	מיליפור	MAB353	עכבר (1:1000)
BrdU	אבקאם	dorit_19977	חולדה (1:500)
פניצילין
סטרפטומיצין
מיקרוסקופ מנתח
צנטריפוגה
פיפטה P1000
אמבט מים
אינקובטור CO2
כחול טריפאן
המטוציטומטר