הקמת תרבית משותפת של תאי מוך השן ונוירונים טריגמינליים לתקשורת צולבת

תקציר

מקור: Barkley, C. et al., שיטה לתרבות משותפת לחקר צמיחת נוירוטים בתגובה לאותות פרקריניים במוך השן.J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מציג טכניקה לביסוס תרבית משותפת של נוירונים טריגמינליים ותאי מוך שיניים ראשוניים באמצעות מסנן טרנסוול. במצב זה של הפרדה פיזית, תאים מזנכימליים המתקבלים מרקמת מוך השן מפרישים מולקולות איתות פרקריניות החוצות דרך הנקבוביות, ומקדמים התמיינות ונדידה של נוירונים לעבר התאים המזנכימליים היוצרים מערכת תרבית משותפת.

פרוטוקול

1. הכנת הצלחת

NOTE: ודא שמכסה הצלחת דולק במהלך כל שלבי הדגירה והשטיפה מחוץ למכסה המנוע של תרבית הרקמה הסטרילית כדי למנוע זיהום במהלך עיבוד הדגימה.

1. מסנני ציפוי
   1. לדלל למינין ל 10 מיקרוגרם / מ"ל. סנן את הלמינין המדולל מתחת למכסה המנוע.
   2. פיפטה 450-500 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל למינין לתוך כל באר של צלחת 24 באר.
   3. מניחים מסנן טרנסוול, נקבוביות 3 מיקרומטר, בבאר, כך שהוא בא במגע עם תמיסת הלמינין ומשאירים אותו באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים או לילה. נקבוביות המסנן אמורות לאפשר לחלק מהתמיסה להתפזר ולצפות הן את החלק העליון והן את החלק התחתון של המסנן. מסננים אלה יש להשתמש בתוך 48 שעות או להיות בקירור ב 4 ° C במשך עד שבוע אחד.

2. ציפוי תאים

1. עכברים: שינוי גנטי של תאי מוך השן (DP) יכול להתבצע (אך אינו נדרש) כדי לחקור אינטראקציות מזנכימליות-עצביות.
2. דיסקציה, פיזור וציפוי DP (איור 1)
   הערה: לדיסקציה של DP, השתמש במלקחיים דקים במיוחד בעלי קצה ישר. הקצוות העדינים במיוחד יאפשרו למשתמש לתקוע טריז בקצה המלקחיים בין המבנה המינרלי לבין רקמת ה-DP.
   1. קציר עכברי P5-P8. בשלב זה, השיניים צריכות להיות מינרליזציה, והשורש פתוח.
   2. מרדימים את היילודים באמצעות היפותרמיה על ידי הכנסתם לצלחת במקרר 4 מעלות צלזיוס עד שהם כבר לא זזים או מגיבים למגע. יש להרדים יילודים באמצעות עריפת ראשים ובהתאם לנוהלי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במתקן הייעודי.
   3. הכינו אליציטוט 3-5 מ"ל של 0.25% חומצה טטראצטית טריפסין-אתילאנדיאמין (טריפסין-EDTA) בצינור חרוטי של 50 מ"ל כדי לאסוף את ה-DP מכל עכבר. זה יקל על העיכול של מוך שיניים מעכברים לאחר הלידה. השתמש יותר מ 3 מ"ל אם לעכל רקמות מיותר מ -10 עכברים לאחר הלידה.
   4. הניחו את הראש על כרית תחתונה חד פעמית כך שהפה יהיה לכיוון התקרה ובסיס הצוואר שטוח על משטח העבודה. השתמש בסכין גילוח בתנועת ניסור כדי להפריד את הלסת התחתונה מהמקסילה.
   5. לחלופין, הסר את הלשון עם מספריים או עם מלקחיים כדי לאפשר גישה קלה יותר לטוחנות.
   6. הניחו את הראש הפתוח בצלוחית על גבי משטח גזה סטרילי והניחו את הדגימה תחת מיקרוסקופ מנתח (איור 1D).
   7. הסר את רקמת העצם הנאדית סביב הטוחנות הראשונות. שיניים תת-לסתיות אינן בוקעות במלואן בשלב זה. הכניסו מלקחיים לפתח מכתשית והרחיקו את הרקמה מהשן לכיוון הצד הבוקאלי (לחי) או הלשוני (לשון) של הפה. שיניים מקסילריות ידרשו הסרה מלאה של השסע סביב השן לצורך חשיפה ועקירה.
   8. העבירו בעדינות את הטוחנות הראשונות התת-לסתיות והמקסימליות (M1s) לצלחת תרבית תאים נפרדת עם מלח חוצץ פוספט 1x (PBS).
   9. חזור על הפעולה 2.2.4-2.2.8 עד לאיסוף כל M1s. שמור את התבשיל המכיל M1s על קרח במהלך הקציר.
   10. הסר את האיבר החיצוני של האמייל (EOE) המקיף את החלק החיצוני של כל M1. לחילופין, ניתן לעשות זאת לאחר שלב 2.2.11.
   11. בעזרת קבוצה של מלקחיים, סובבו את ה-M1 כך שהמלקחיים יהיו למטה והשורש הפתוח ייחשף. יהיה פתח אליפטי בתחתית השן, ורקמת DP אטומה עטופה בשכבה דקה של דנטין ואמייל.
   12. בעזרת קצה המלקחיים, שחררו בעדינות את ה-DP על ידי העברת זרוע אחת של המלקחיים סביב ההיקף הפנימי של הרקמה המינרלית. הסר רקמת DP מהמבנה המינרלי והעבר אותה לצלחת שלישית המכילה PBS 1x. הסירו את ה-EOE אם הוא עדיין לא הופרד (איור 1E).
   13. העבר את כל רקמת DP ל- 0.25% טריפסין-EDTA בצינור חרוטי של 50 מ"ל. מערבבים את התערובת ומניחים באמבט מים חמים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ניתן לעשות זאת עם אותם מלקחיים או עם מלקחיים ארוכים ובקבוקונים. הרקמה תהיה קשה לפיזור ותדרוש מערבולות כל 3-4 דקות. אין לחרוג מ-10 דקות טריפסיניזציה, שכן הטריפסין עלול לפגוע בקרומי התא.
   14. מתחת למכסה מנוע סטרילי, הוסף מדיה מחוממת לתרבית משותפת (טבלה 1) ביחס סופי של לפחות 1:1 מדיה לטריפסין כדי להשבית את האנזים. יחסים גדולים יותר מקובלים אם רוצים פיזור רקמות רב יותר.
   15. פיפטה את המדיה למעלה ולמטה מספר פעמים עם פיפטה 10 מ"ל כדי לפזר עוד יותר את DP בתקשורת. היזהרו להימנע מבועות גדולות. פיזור מלא הוא כמעט בלתי אפשרי בשל האופי הדביק של הרקמה. עם זאת, זה גם לא הכרחי שכן תאים ינדדו החוצה מן הרקמה פעם מצופה.
   16. העבירו 1 מ"ל של העקורים המפוזרים לכל באר של צלחת תרבית רקמה בת 24 בארות (איור 1F).
   17. הניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ואפשרו לתאים להיצמד ולנדוד החוצה מהרקמה הלא מפוזרת במשך 48 שעות לפני שינוי המדיה. תאים ראשוניים צריכים להיות מצופים בריכוזים גבוהים יחסית על מנת להגיע 85-90% מפגש בתוך שבוע אחד. אם זה לא מושג לאחר שבוע, להשליך את הצלחת.
3. דיסקציה של נוירונים טריגמינליים, פיזור וציפוי
   הערה: בפרוטוקול זה, ההדמיה של צמיחת נוירוטים בתרבית משותפת עם תאי DP הייתה אופטימלית באמצעות B6 בגיל ההתבגרות (בן 6 שבועות). Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J עכברים. למערכת העצבים המרכזית וההיקפית של עכברי Thy1-YFP יש תג חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) שהביטוי שלו מתחיל בסביבות P6-P10 בתאי עצב ועולה באופן אקספוננציאלי בכל מערכת העצבים במהלך החיים שלאחר הלידה והבוגרים. YFP ו-GFP שימרו רצפים המאפשרים לעצבים אלה להיות מוכתמים בנוגדנים נגד GFP, וכתוצאה מכך נוצר כתם פאן-עצבי. בסופו של דבר, עכברים אלה מאפשרים הדמיה טובה יותר וכימות של תאי העצב המשמשים וגדלים בתרבית תאים.       
   1. הרדימו עכברים מתבגרים עם פחמן דו חמצני ואחריו נקע צוואר הרחם.
   2. ערפו את ראשיהם של העכברים והסירו את העור מהגולגולת. הקפד לכלול מספר שווה ערך של זכרים ונקבות.
   3. הכנס קצה של זוג מספריים מיקרו-מנתחים לבסיס הגולגולת. חתכו לאורך תפר הקשת של הגולגולת (איור 1A).
   4. בצע ארבעה חתכים אופקיים קטנים: שניים לאורך התפרים העטרתיים ליד האוזניים, ושניים לאורך התפרים הלמבדואידים בבסיס הגולגולת. זה אמור ליצור שני דשים של עצם.
   5. השתמש במלקחיים כדי לקלף בחזרה את שני דשי העצם. זה אמור לחשוף את המוח.
   6. הסר את המוח. מעבירים את הראש לצלחת תרבית רקמה עם PBS 1x ומכניסים מתחת למיקרוסקופ.
   7. אתרו את גרעיני הטריגמינל (TG), שניתן לראות בקלות במכרסמים¹³, השוכנים בדורה מאטר שבין המוח לעצם של התהליך המקסילרי (איור 1B).
   8. חותכים את שלושת הענפים שמגיעים לעיניים, מקסילה ולסת, ומעבירים את הגרעינים ל-PBS 1x קר בעזרת מלקחיים עדינים בעלי קצה ישר. שמור את התבשיל המכיל את גרעיני TG על קרח במהלך הקציר.
   9. לאחר שכל צרורות TG נקצרים, מעבירים את הגרעינים לצינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 5 מ"ג / מ"ל קולגן סטרילי מסונן מסוג II באמצעות מלקחיים בקבוקון.
   10. מערבבים את הקולגנאז עם צרור TG ומניחים את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 25-30 דקות. במהלך תקופה זו, להוציא את הצינור החרוטי מתוך אמבט המים, מערבולת, ולחזור לאמבטיה כל 5-10 דקות.
   11. צנטריפוגה את תמיסת הנוירון collagenase-TG למשך 2 דקות ב 643 x גרם.
   12. מתחת למכסה המנוע של תרבית רקמה, שאפו בעדינות את הקולגנאז בעזרת מיקרופיפטה.
   13. הוסף 5 מ"ל של טריפסין מסונן סטרילי 1% סוג II ומערבולת. הניחו את הצינור החרוטי באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   14. צנטריפוגו את תערובת טריפסין-TG במשך 5 דקות ב 643 x גרם. הסר את החלק העליון של טריפסין עם micropipette, כך נוירונים TG לא מוסרים. עדיין יהיה נוזל בצינור.
   15. הוסף מדיה מספקת כדי להשבית את יתרת הטריפסין (ביחס של 1:1 או פחות של טריפסין למדיה).
   16. ספרו את מספר התאים ודללו את התמיסה ל-200,000 תאים/מ"ל (250 מיקרוליטר תאים המכילים 50,000 תאים).
   17. הכניסו מסנני טרנסוול מצופים מסעיף 1.2 לבארות עם DP.
   18. לדלל את התמיסה המכילה את התא כך שיהיו 200,000 תאים/מ"ל. פיפטה 250 μL על מסנן הטרנסוול, ותרבית את התאים בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה (איור 1F).
   19. למחרת, החלף את המדיה עם 1 מ"ל של מדיה Co-culture עם 1 μM uridine ו 15 μM 5'-fluoro-2 deoxyuridine כדי לעצור את התפשטות יתר של תאים mesenchymal שעשוי למנוע צמיחה של neurit. אופציונלי: הוסף גורמי גדילה או מעכבים במדיה זו אם אתה מנסה לבצע מניפולציה נוספת.

טבלה 1: מדיה תרבותית משותפת.

רכיב	נפח	ריכוז
MEM α	440 מ"ל
יש לחמם נסיוב בקר עוברי מומת	50 מ"ל	10%
100x L-גלוטמין	5 מ"ל	1x
פניצילין-סטרפטומיצין 100 x	5 מ"ל	1x
שנה מדיה ביום 2 עם מעכבי מיטוטי בריכוזים סופיים אלה
אורידין		1 מיקרומטר
5'-Fluor-2'deoxyuridine		15 מיקרומטר

תוצאות

איור 1: סכימה של דיסקציה של עכבר כדי להשיג תאים לתרבית משותפת.(A) תרשים של היכן לחתוך כדי לפתוח את גולגולת העכבר ולאתר עצבי TG, המוצגים בשחור בתיאור האחרון. מספריים מציינים היכן להכניס את קצות המספריים לגזירה לאורך הקווים המקווקוים. (B) תמונה משולבת של שדה כהה ו-GFP המציגה עצבי TG מסוג Thy1-YFP+ המעוגלים בלבן. (C) גרעיני TG מנותחים יכולים אז להיות מפ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5-פלואורו-2'-דאוקסיורידין	סיגמא-אולדריץ'	F0503	משמש כמעכב מיטוטי בריכוז של 15 מיקרומטר במדיה של תרבית משותפת, יום 2
24 צלחת תרבית תאים באר	קורנינג	3524	צלחת תרבות משותפת
ב6; 129- Tgfbr2tm1Karl/J	מעבדת ג'קסון	12603	מודל עכבר Tgfbr2f/f המשמש לתאי מוך שן שיניים בפרוטוקול אופטימלי
ב6. Cg-TG(Thy1-YFP)16Jrs/J	מעבדת ג'קסון	3709	גנוטיפ מודל עכבר Thy1-YFP המשמש לנוירונים טריגמינליים
קולגנאז סוג II	מיליפור	234,155-100 מ"ג	משמש לפיזור נוירונים טריגמינליים
סרום בקר עוברי	גיבקו	10437	תוסף למדיה של תרבות משותפת
מלקחיים עדינים	כלים מדעיים משובחים	11413-11	מלקחיים עדינים לדיסקציה TG
למינין	סיגמא-אולדריץ'	L2020	מצפה את תוספות הטרנסוול בריכוז סופי של 10 מק"ג/מ"ל, תמיסת הציר מניחה 1.5 מ"ג/מ"ל
ל-גלוטמין	גיבקו	25030081	תוסף למדיה של תרבות משותפת
מספריים לניתוח זעיר	סיגמא-אולדריץ'	S3146-1EA	מספריים לדיסקציה לפתיחת גולגולת
מדיום חיוני מינימלי א	גיבקו	12571063	בסיס מדיה של תרבות משותפת
פניצילין-סטרפטומיצין	גיבקו	15070063	תוסף אנטיביוטי למדיה של תרבית משותפת
מעכב פוספטאז	סיגמא-אולדריץ'	04 906 837 001	תוסף RIPA Buffer לחילוץ חלבון מתאי מוך השן לאחר תרבית משותפת
תוספת תרבית תאים ThinCert	גריינר ביו-וואן	662631	תוספות Transwell עבור נוירונים טריגמינליים במבחני תרבית משותפת
טריפסין-EDTA (0.25%)	גיבקו	25200056	FTO משומש מפזר תאי מוך שיניים
טריפסין סוג II	סיגמא-אולדריץ'	T-7409	משמש לפיזור נוירונים טריגמינליים
מלקחיים עדינים במיוחד	כלים מדעיים משובחים	11370-40	מלקחיים עדינים במיוחד לדיסקציה
אורידין	סיגמא-אולדריץ'	U3750	משמש כמעכב מיטוטי בריכוז של 1 מיקרומטר במדיה של תרבית משותפת, יום 2
מלקחיים בקבוקונים	כלים מדעיים משובחים	110006-15	מלקחיים ארוכים להעברת רקמות לחרוטיים