1. תרבית ואחסון של תאי אנדותל פריוונטריקולריים אנושיים
- לשמור על תאי אנדותל פריוונטריקולריים אנושיים על מטריצת קרום מרתף מצופה מטריצה (ראה טבלת חומרים) לוחות 6 בארות בתווך תאי אנדותל פריוונטריקולרי (מדיום E6 המכיל 50 ng/mL גורם גדילה אנדותל כלי דם A [VEGF-A], 100 ng/mL גורם גדילה פיברובלסט 2 [FGF2] ו-5 מיקרומטר חומצה גמא-אמינובוטירית [GABA]) ב-37°C ו-5% CO2. החליפו מדיום כל יום לסירוגין.
- הפשירו את מטריצת קרום המרתף בטמפרטורה של 4°C, וצרו תמיסה ביחס של 1:100 על ידי דילול שלה בתווך F-12 (DMEM/F12) של Dulbecco קר. מצפים כל באר של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ל של פתרון מטריצה. יש לדגור על צלחות בטמפרטורה של 37°C למשך שעה לפחות לפני השימוש.
- לאפשר לתאי אנדותל פרי-חדריים אנושיים להגיע למפגש של 80%-90%. שאפו מדיום מהבאר. שטפו את הבארות פעם אחת עם 1 מ"ל של מלח סטרילי 1x פוספט חוצץ (PBS) לכל באר.
- נתק תאים על-ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה של תאים (ראה טבלת חומרים) לכל באר. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, להוסיף 1 מ"ל של תווך תא אנדותל periventricular. העבר את תמיסת התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
הערה: אנו משתמשים ב- Accutase לדיסוציאציה של תאים כאן, בניגוד ל- TrypLE בסעיפים 3 ו- 4.
- תאי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, שואפים את supernatant ו resuspend את כדור התא ב 1 מ"ל של תווך תא אנדותל periventricular.
- ספירת תאים חיים באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן. תאי זרעים בצלחות טריות מצופות מטריצה בצפיפות של 1.2 x 105 תאים לסמ"ק2. יש לדגור ב-37°C וב-5% CO2.
- אחסן תאי אנדותל פריוונטריקולריים אנושיים על ידי שימור בהקפאה בתווך הקפאה (90% תווך תאי אנדותל פריוונטריקולרי ו-10% דימתיל סולפוקסיד [DMSO]).
- נתק ואסוף תאים בהתאם לשלבים 1.3 ו- 1.4 לעיל. ספירת תאים בתמיסה בשיטת ההדרה הכחולה של טריפאן.
- תאי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב 5 x 106 תאים / מ"ל של מדיום הקפאה.
- יש להוציא 1 מ"ל של תאים בינוניים פלוס מקפיאים לכל קריוביאלי. הניחו את הבקבוקונים בתא מלא איזופרופנול וצננו למשך הלילה בטמפרטורה של -80°C בטמפרטורה של 1°C/min. העבירו בקבוקונים למיכל חנקן נוזלי למחרת לאחסון לטווח ארוך.
2. הכנת תאי אנדותל פריוונטריקולריים אנושיים לבדיקה
- לאפשר לתאי אנדותל פריוונטריקולריים אנושיים להגיע למפגש של 70%-80%.
- נתק תאים לאחר שלבים 1.3 עד 1.5 כמתואר לעיל. ספירת תאים באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן.
3. הכנת GABAergic Interneurons אנושי לבדיקה
הערה: תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC)-שמקורם בתאי גזע GABAergic והמדיום העצבי נרכשו באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים). תאי העצב נוצרים על ידי התמיינות קו iPSC אנושי שמקורו בפיברובלסטים בעקבות פרוטוקול שפותח על ידי היצרן. התאים הופשרו ותורבתו על פי פרוטוקול היצרן.
- הפשירו תאי עצב פנימיים מסוג GABAergic אנושיים ותרבו אותם בצלחת של 12 בארות למשך שבועיים למפגש של 70%-80%.
- ביום הבדיקה, תמיסת דיסוציאציה של תאים חמים (ראה טבלת חומרים) ואליציטוט של תווך עצבי ב 37 ° C במשך 10 דקות לפני השימוש.
- שאפו מדיום מכל באר המכילה את התאים. לשטוף תאים עם 1 מ"ל של סטרילי 1x PBS לכל באר.
- נתק תאים על ידי הוספת 0.5 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה מחוממת מראש לכל באר ודגור ב 37 ° C במשך 5 דקות. הוסף 1 מ"ל של מדיום עצבי לכל באר. העברת תמיסת תאים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. בצע triturate בעדינות כדי לנתק גושי תאים.
- תאי צנטריפוגה ב 380 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, שואפים supernatant ו resuspend את כדור התא ב 1 מ"ל של תווך עצבי. ספירת תאים חיים באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן.
4. הכנת ביקורת תאי אנדותל אנושיים לבדיקה
הערה: בקרת תאי אנדותל שמקורם בתאי אנדותל iPSC אנושיים ומדיום תאי אנדותל נרכשו באופן מסחרי (טבלה של חומרים). תאי אנדותל אלה נוצרים על ידי התמיינות קו iPSC שמקורו בפיברובלסטים אנושיים לגורל האנדותל בעקבות פרוטוקול שפותח על ידי היצרן. התאים הופשרו ותורבתו על מצע פיברונקטין בהתאם לפרוטוקול היצרן. לוחות מצופים פיברונקטין הוכנו בהתאם לפרוטוקול היצרן.
- ההפשרה שולטת בתאי אנדותל אנושיים ומתרבית אותם בצלחת בעלת 6 בארות למפגש של 80%-90%.
- ביום הבדיקה, תמיסת דיסוציאציה של תאים חמים (ראה טבלת חומרים) ואליציטוט של תווך אנדותל ב 37 ° C למשך 10 דקות לפני השימוש.
- שאפו את התווך מכל באר המכילה את התאים. לשטוף תאים עם 1 מ"ל של סטרילי 1x PBS לכל באר.
- נתק תאים על ידי הוספת 0.5 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה שחוממה מראש לכל באר. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הוסף 1 מ"ל של תווך תאי אנדותל לכל באר כדי לנטרל את תמיסת הדיסוציאציה. העברת תמיסת תאים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
- תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשאוף supernatant ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של תווך תא אנדותל. ספירת תאים חיים באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן.
5. הכנת תוספות תרבות באר אחת
- הפשיר 1 מ"ג / מ"ל תמיסת למינין בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C.
- מצפים מספר מתאים של כלים 35 מ"מ בתמיסת 0.01% פולי-L-אורניתין (1 מ"ל למנה). לדגור את הכלים בטמפרטורת החדר לפחות 1 שעה.
- יש לדלל 1 מ"ג/מ"ל תמיסת למינין 1:300 במים סטריליים לריכוז סופי של 3.3 מק"ג/מ"ל מיד לפני השימוש.
- שאפו לחלוטין פולי-L-אורניתין מכל מנה. יש לשטוף ביסודיות כל כלי 3 פעמים במים סטריליים ולשאוף לחלוטין כדי למנוע רעילות תאים הנגרמת על ידי פולי-L-אורניתין.
- יש להוסיף 1 מ"ל של תמיסת למינין 3.3 מק"ג/מ"ל לכל מנה ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה או לפחות שעה אחת. יש להסיר את תמיסת הלמינין מהתבשיל מיד לפני השימוש.
הערה: לחלופין, אחסנו את הכלים המכילים למינין ב-4°C. אזנו את הכלים באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש.
- חתכו שלוש צלעות של באר אחת של תרבית סיליקון בעלת שתי בארות (איור 1A) באמצעות להב סטרילי כדי ליצור תוספת של באר אחת (איור 1B).
הערה: יש לשמור את שתי הבארות צמודות היטב לפני השטח של האריזה המקורית בזמן החיתוך, כדי להבטיח חיתוך חלק ולהגן על ההדבקה של העלון.
- לשאוף פתרון למינין מן המנות.
הערה: אין לשטוף את הכלים עם PBS סטרילי או מים לאחר דגירה למינין. משטחים רטובים ימנעו הדבקה הדוקה של תוספת התרבית.
- מוציאים היטב עם פינצטה סטרילית ומניחים אותה במרכז הכלי המצופה פולי-L-אורניתין/למינין. לחץ לאורך קצוות העלון כדי לקבע אותו לפני השטח של המנה.
- הפוך בזהירות את הצלחת כדי לוודא שהעלון מודבק היטב.
- השאירו את הכלי הפוך וסמנו את גבול תא ההוספה באמצעות טוש שחור קבוע עם קצה דק במיוחד (איור 1C).
6. תרבות משותפת בדיקת הגירה
- קו-השעיה 3 x 104 GABAergic interneurons ו 3 x 104 תאי אנדותל פריוונטריקולרי אנושי ב 70 μL של מדיום תרבית משותפת (50% תווך תחזוקה periventricular ללא GABA ו 50% תווך עצבי). זרעו את תמיסת התא הזו בתוך התא בעל הבאר האחת. הכינו מספר מתאים של מנות בדיקה כאלה.
הערה: GABA לא נוסף במדיום התרבות המשותפת כדי לא לכלול את ההשפעה של GABA אקסוגני על הגירה.
- בדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שתאים אינם דולפים מתא ההחדרה.
- הוסיפו באיטיות 1 מ"ל של מדיום תרבית משותפת לאורך דופן התבנית כדי למנוע מהציפוי להתייבש.
הערה: מוסיפים בינוני באיטיות לאורך קצה המנה, כך שהתוספת לא תופרע.
- כבקרה ראשונה, זרע 3 x 104 נוירונים בין-עצביים GABAergic אנושיים רק ב 70 מיקרוליטר של מדיום תרבית משותפת לכל החדרת באר אחת. הכינו מספר מתאים של מנות כאלה.
- כבקרה שנייה, co-seed 3 x 104 GABAergic Human interneurons with 3 x 104 control human endothelial cells in 70 μL of co-culture medium per one-well insert. הכינו מספר מתאים של מנות.
- לדגור את הכלים במשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2. לאחר דגירה של 24 שעות, בדקו תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים התחברו כראוי ואין דליפה.
- לאחר 48 שעות של זריעה, להסיר בעדינות את העלון באמצעות טוויטר סטרילי. בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא ששכבת התא אינה מופרעת (יום 0).
- הסר מדיום והוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית משותפת טרייה.
הערה: הקדישו מספר מתאים של מנות לרכישת תמונות יום 0.
- לדגור על תאים במשך 5 ימים ב 37 ° C ו 5% CO2.
