כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. ציפוי הפרוסות על התוספות
- ממלאים כל באר של צלחת בת 6 בארות ב-1,200 מיקרוליטר של מצע תרבית פרוסה. מלא בארות שאינן בשימוש ב- 1,200 μl PBS ומלא את החלל המרכזי של הצלחת ב- 5 מ"ל 1x PBS. אחסנו צלחת זו בטמפרטורה של 37°C.
- בעזרת כלי הכף המחוררת, הניחו פרוסת מוח במדיה שעל העלון, ודחפו בעדינות את הפרוסה כך שתשקע במלואה. חזרו על הפעולה לכל הפרוסות.
- השתמשו ב-p1000 כדי לשלוף 1 מ"ל של חומר תרבית לפרוסות מהחלק העליון של האינסרט ופזרו אותו לתחתית הבאר. מוציאים ומשליכים את עודפי המדיה עד שקצוות האגרוז סביב פרוסת המוח הופכים גלויים. עשו זאת עבור הפרוסות הנותרות.
- הרימו את האינסרט ליד השפה בעזרת מלקחיים, הטו והסירו עודפי מדיה. לאחר מכן, העבירו במהירות את האינסרט לצלחתבגודל 35 מ"מ 2 המכילה 1 מ"ל של תרבית פרוסה. השתמשו ב-2 זוגות מלקחיים חדים כדי להסיר את האגרוז סביב הרקמה, תוך הקפדה שלא למתוח/לפגוע, לחתוך או לדקור חור בקרום (הכי קל אם אתם עושים קרע ממש בקצה האגרוז, ואז מפרקים את האגרוז משני הצדדים). לאחר מכן, החזירו את התוספת לצלחת בעלת 6 הבארות וחזרו על הפעולה לקבלת הפרוסות הנותרות.
- בתרבית רקמה עם המפוח כבוי (כדי למנוע התייבשות פרוסות), מסירים שברי אגרוז מכל ממברנה.
- מעבירים את הפרוסות לצלחת בעלת 6 בארות שהוכנה בשלב 1.1 ומאחסנים את הצלחת ב-37°C. דוגרים על הפרוסות למשך 24-48 שעות.
2. שינוי הפרוסה מדיה תרבותית
- חזור על שלב 1.1 עם צלחת טרייה עם 6 בארות.
- במכסה מנוע של תרבית רקמה כשהמפוח כבוי, מעבירים את התוספות לצלחות חדשות בנות 6 בארות המכילות מצע פרוסות טרי.
3. ציפוי תאי גידול על הפרוסה
- סוניק את צבע Cm-DiI וסובב במהירות בינונית במשך 2 דקות.
- ספין כלפי מטה את תאי הגידול המשמשים לכיסוי ב 201 x גרם במשך 5 דקות. לאחר מכן להשעות מחדש ב 2 מ"ל של פרוסת מדיה תרבית.
- הוסף 7 μl של Cm-DiI לתוך 2 מ"ל של תאים ומדיה לדגור ב 37 ° C במשך 20 דקות.
- סובב תאים כלפי מטה במהירות של 201 x גרם למשך 5 דקות והשהה מחדש ב- 200 μl של מדיה לפרוס. עשו טריטורציה עדינה כדי לנתק את התאים (10-20 פעמים או עד שהגלולה נעלמת) ולאחר מכן הוסיפו מדיה לחיתוך 800 μl כדי ליצור נפח כולל של 1,000 μl.
- ספירת תאי גידול קיימא באמצעות כחול טריפאן. הוסף מיקרוספרות פלואורסצנטיות ירוקות לתאי הגידול באותו ריכוז כמו תאים. מיקרוספרות אינרטיות אלה ישמשו כבקרה. יש לסובב את תערובת התא/מיקרספירה, בטמפרטורה של 201 x גרם למשך 5 דקות, ולהשהות מחדש בכמות הרצויה של תרבית פרוסות. תאי צלחת בצפיפות של 6,000 תאים/פרוסה בנפח 65 μl. ניתן להגדיל את מספר התאים המצופים בכל פרוסה בהתאם להעדפה ולזמינות.
- בתרבית הרקמה, יש לפזר תאים בנפח 65 מיקרוליטר מדיה/פרוסה למרכז הפרוסה.
