$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת MEAs
הערה: MEAs מורכבים ממצע זכוכית, אלקטרודות מתכת מיקרו-מפוברקות ושכבת בידוד פולימרית SU-8. לצורך מחקר זה, הוזמנו MEAs זמינים מסחרית עם מערך אלקטרודות מותאם אישית (איור 1 A&B). 68 האלקטרודות מסודרות ברשת מלבנית המפוצלת לשני אזורים על ידי חריץ ברוחב 300 מיקרומטר ללא אלקטרודות, מוליכים חשמליים ובידוד. גודלה של כל אלקטרודה הוא 40X40 מיקרומטר, והם מרווחים זה מזה ב-200 מיקרומטר מהמרכז למרכז. ארבע אלקטרודות הארקה גדולות ממוקמות סביב אתר ההקלטה. הם נבדלים מ- MEAs סטנדרטיים אחרים הזמינים מסחרית בגודלם (21 מ"מ x 21 מ"מ) ואין להם תא הקלטה קבוע.
- לחיטוי יש לשטוף MEAs ב-100% אתנול (2x), 70% אתנול (1x) ומים מזוקקים (2x) למשך 30 שניות לפחות כל אחד. תנו לו להתייבש. שים 10 - 12 MEAs בצלחת פטרי זכוכית נקייה (150 מ"מ x 25 מ"מ) ולסגור את המכסה.
- Autoclave MEAs למשך 20 דקות ב-120°C. יש לאחסן ב-RT.
- הכן את תמיסת הציפוי (ראה רשימת חומרים) עבור MEAs ואחסן aliquots ב -20 ° C.
- שים כל MEA בצלחת פטרי סטרילית נפרדת (35 מ"מ x 10 מ"מ).
- השתמש פיפטה מקורר לשים 150 μl תמיסת ציפוי מקורר על גבי האלקטרודות לסגור את המכסה של צלחת פטרי. לאחר כ-10 דקות, בדקו אם יש בועות אוויר על גבי האלקטרודות והסירו אותן בעדינות בעזרת מרית מכוסה גומי במידת הצורך. תנו לנוח שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT).
- שאריות תמיסת ציפוי לשאוף, לשטוף 1x עם מדיום מותאם עבור נוירונים טרום לידתי ועוברי ו 2x עם מים מזוקקים סטריליים. אם לא משתמשים ב-MEAs עד למחרת, יש לשמור אותם במים מזוקקים וסטריליים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור למשך הלילה (O/N). אחרת, תן להתייבש ישירות ב- RT.
2. מרכיבים הדרושים להכנת וצמיחה של תרבויות אורגנוטיפיות
- הכינו תמיסת שטיפה נטולת סידן (ראו רשימת חומרים).
- הרכיבו מחדש את פלסמת העוף בתמיסת שטיפה (1:1, נערו בעדינות, הימנעו מהיווצרות בועות), צנטריפוגה בגודל 3,000 x גרם למשך כ-20 דקות ורוקנו את התוכן השקוף לצינור סטרילי. Aliquot 200 μl לתוך cryotubes ולאחסן ב -20 ° C.
- לשחזר תרומבין מפלסמת בקר בהתאם (200 U / ml) ומסנן סטרילי (0.2 מיקרומטר מסנן נקבוביות). Aliquot 200 μl לתוך crytotubes ולאחסן ב -20 ° C.
- עבור 30 תרביות להכין 100 מ"ל של מדיום מזין (ראה רשימת חומרים).
3. דיסקציה של רקמת חוט השדרה
הערה: ההליך מניב, בהתאם למספר העוברים, פרוסות חוט שדרה לכ -25 - 35 תרביות משותפות ומוכן בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית בתנאים סטריליים.
- החל מינון קטלני של pentobarbital (0.4 מ"ל) על חיית האם על ידי הזרקה תוך שרירית. יש לאשר הרדמה עמוקה על ידי בדיקת רפלקס הגמילה מהדוושה. ליילד עוברי יום 14 (E14) עוברי חולדה בניתוח קיסרי ולהקריב על ידי עריפת ראש.
- מעבירים את גופות העוברים לצלחת פטרי מלאה בתמיסת כביסה סטרילית ומקוררת.
- בצע חתך רוחבי שלם אחד עם אזמל מעל הגפיים האחוריות ועוד אחד מעל הגפיים הקדמיות והסר את הגפיים מהגוף. לאחר מכן, בצע חתך במישור הקדמי כדי להפריד את הקרביים מהחלק האחורי המכיל את חוט השדרה.
- לחיתוך, להעביר את החלקים האחוריים המכילים את חוט השדרה אחד בכל פעם על דיסק הרכבה לחתוך בעובי של 225 - 250 מיקרומטר עם מסוק רקמות. מניחים טיפה של תמיסת כביסה על הרקמה הקצוצה ומעבירים פרוסות עם מרית בכלי פטרי בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ מלאים בתמיסת כביסה סטרילית ומקוררת.
- עבור כל פרוסה בנפרד, יש לנתח את חוט השדרה הרחק מהרקמה שנותרה. השאירו את גרעיני השורש הגבי מחוברים.
- תנו לפרוסות לנוח במשך שעה אחת ב 4 °C (75 °F).
4. הרכבת פרוסות רקמת חוט השדרה על MEAs
- מחממים מדיום מזין סטרילי באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, מכסה לא מוברג קלות לחמצון).
- מקם MEA עם פינצטה סטרילית עם קצוות מכוסים גומי ב- RT בצלחת הפטרי מתחת למיקרוסקופ סטריאו עם מערך האלקטרודות ממוקד. מרכז טיפת 6 μl של פלסמת עוף על מערך האלקטרודות הנקי, נטול האבק והסטרילי. בעזרת מרית קטנה, החליקו בזהירות שני חלקי חוט שדרה עם דפנות גחון הפונות זו לזו לתוך טיפת הפלזמה. אין לגעת באלקטרודות עם המרית.
- מוסיפים 8 μl של תרומבין סביב טיפת פלזמה עוף. בעזרת קצה פיפטת הטרומבין, מערבבים בזהירות ומפזרים את תערובת הפלזמה/טרומבין סביב שתי הפרוסות. שוב, אין לגעת ישירות במערך האלקטרודות השביר. רגע לפני הקרישה, יש לשאוף עודפי פלזמה/תרומבין עוף.
- מכסים את צלחת הפטרי כדי לשמור על לחות גבוהה בזמן שמכלול MEA / תרבית יושב כשעה בתא לח בתוך האינקובטור ב -37 מעלות צלזיוס.
- מוסיפים בזהירות 10 מיקרוליטר של חומר מזין לתא התרבית, מכסים את צלחת הפטרי ומחזירים לאינקובטור למשך כ-30 דקות.
- הכניסו כל מכלול MEA/תרבית עם קצוות סטריליים מכוסים גומי לתוך צינור רולר, הוסיפו 3 מ"ל של חומר מזין וסגרו היטב את המכסה. מניחים את צינור הרולר בתוף הרולר מסתובב ב 1 - 2 סל"ד באינקובטור באטמוספירה המכילה 5% CO2 ב 37 ° C.
- שנה מחצית של מדיום מזין לאחר 7 ימים במבחנה (DIV) ולאחר מכן 1 - 2 פעמים בשבוע.
5. נגעים מכניים
- הוציאו את מכלול MEA/תרבית עם קצוות סטריליים מכוסי גומי מצינור הרולר והניחו בצלחת פטרי ללא מדיום מזין תחת מיקרוסקופ סטריאו כשהרקמה ממוקדת. ודאו חזותית ששתי הפרוסות מאוחות.
- החזיקו את מכלול MEA/תרבית יציב על ידי הנחת פינצטה עם קצוות מכוסים גומי על MEA.
- מניחים להב אזמל בחריץ של MEA קרוב לפרוסות הרקמה. החזק את האזמל בצורה אופקית למדי.
- הרימו את ידית האזמל כלפי מעלה, אך הניחו ללהב האזמל להישאר בחריץ של ה-MEA באופן כזה שהלהב "מתגלגל" מהבסיס לקצה ובכך חותך את הרקמה המכסה את החריץ.
- חמור כל שאריות רקמה חיבורים עם קצה מחט 25 G במידת הצורך. יש לעבוד רק באזור שבתוך החריץ ולא לגעת בקצוות העדינים.
- החזירו את מכלול MEA/תרבית לצינור הרולר. לספק 3 מ"ל של מדיום מזין טרי לתרביות ולהחזיר אותם לתוף הרולר באינקובטור.
6. רישומים אלקטרופיזיולוגיים של פעילות ספונטנית
- כדי לחקור רגנרציה תפקודית בין שתי פרוסות חוט השדרה לאחר המספר הנבחר של DIV, הרכיבו את מכלול MEA/תרבית בתא הקלטה במיקרוסקופ והשתמשו בתמיסה חוץ-תאית של כ-500 μl (ראו רשימת חומרים).
- המתן 10 דקות לפני ההקלטה הראשונה כדי לאפשר למערכת להתייצב.
- הקלט פעילות ספונטנית בסיסית 2x במשך כ-10 דקות מכל אלקטרודה לזיהוי פעילות של MEA ב-RT.
- כדי להבטיח תנאים חוץ-תאיים יציבים, החליפו תמיסה חוץ-תאית לאחר כל הקלטה.
