יצירת אורגנואידים צרבלריים בוגרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים באמצעות ביוריאקטורים חד-פעמיים

תקציר

מקור: Silva, T.P., et al. Scalable Generation of בוגרים Cerebellar Organoids מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי Immunostaining. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת אורגנואידים צרבלריים בוגרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות ביוריאקטור תלת-ממדי חד-פעמי. הביוריאקטור מאפשר יצירת אגרגטים iPSC, אשר לאחר מכן עובר טיפול עם סדרה של מדיה תרבית מועשרת בגורמי גדילה וכימוקינים המביאים להתמיינות של אגרגטים iPSC לאורגנואידים צרבלריים בוגרים. לאחר מכן, האורגנואידים נקצרים ונשמרים בהקפאה לניתוח נוסף.

פרוטוקול

1. זריעת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים בביוריאקטור

1. יש לדגור על תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הגדלים כחד-שכבות ב-mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר של מעכב ROCK Y-27632 (ROCKi). הוסף 1 מ"ל של תוספת בינונית לכל באר מצלחת תרבית רקמה של 6 בארות ודגרה במשך שעה אחת ב 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO₂.
   הערה: ROCKi משמש להגנה על iPSCs מנותקים מפני אפופטוזיס.
2. לאחר שעה אחת של דגירה, לשאוף את המדיום בילה מכל באר ולשטוף 1x עם 1 מ"ל של 1× PBS לכל באר.
3. הוסף 1 מ"ל של מדיום ניתוק התא (ראה טבלת חומרים) לכל באר של צלחת 6 בארות ודגר ב 37 ° C במשך 7 דקות עד שהתאים מתנתקים בקלות מהבארות עם רעד עדין.
4. פיפטה, תווך ניתוק התא מעלה ומטה עם מיקרופיפטה P1000 עד שהתאים מתנתקים ומתנתקים לתאים בודדים. מוסיפים 2 מ"ל של מדיום תרבית תאים שלם לכל באר כדי להשבית את העיכול האנזימטי ומפיפטים את התאים בעדינות לתוך צינור חרוטי סטרילי.
5. צנטריפוגה ב 210 × גרם במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.
6. השהה מחדש את גלולת התא בתווך תרבית (כלומר, mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר של ROCKi) וספור את iPSCs עם המוציטומטר באמצעות צבע כחול טריפאן.
7. זרעים 15 × 10⁶ תאים בודדים בביוריאקטור (נפח מרבי של 100 מ"ל) עם 60 מ"ל של mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר של ROCKi בצפיפות תאים סופית של 250,000 תאים / מ"ל.
8. הכנס את הכלי המכיל את iPSCs ליחידת הבסיס האוניברסלית הממוקמת באינקובטור ב- 37 ° C, 95% לחות ו- 5% CO₂.
   הערה: ערבוב הביוריאקטור נשמר למשך 24 שעות על ידי הגדרת בקרת יחידת הבסיס האוניברסלית ל-27 סל"ד כדי לקדם צבירת iPSC.

2. התמיינות והבשלה של אגרגטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC) אנושיים באורגנואידים צרבלריים

1. הגדר את יום הזריעה של תא בודד כיום 0.
2. ביום הראשון, לאסוף 1 מ"ל של דגימת אגרגטים iPSC באמצעות פיפטה סרולוגית. שמור על הביוריאקטור תחת תסיסה כמו קודם על ידי הצבת יחידת הבסיס האוניברסלית עם הביוריאקטור המכיל את האגרגטים בזרימה סטרילית לפני איסוף הדגימה. לוחים את מתלה התא בצלחת חיבור נמוכה במיוחד של 24 בארות. בדוק שנוצרים אגרגטים הנגזרים מ- iPSC.
3. קבל תמונות באמצעות מיקרוסקופ אופטי באמצעות הגדלה כוללת של 40x או 100x כדי למדוד את קוטר הצבירה.
4. מדוד את שטח הצברים בכל תמונה באמצעות תוכנת FIJI.
   1. בחר "נתח | הגדר מדידות" משורת התפריטים ולחץ על "שטח" ו "אישור".
   2. בחר "קובץ | פתח" משורת התפריטים כדי לפתוח קובץ תמונה מאוחסן. בחרו בכלי בחירת קווים המוצג בסרגל הכלים וצרו קו ישר מעל סרגל קנה המידה המוצג בתמונה. בחר "נתח | הגדר קנה מידה" משורת התפריטים.
   3. ב"מרחק ידוע", הוסף את המרחב של סרגל קנה המידה של התמונה במיקרומטר. הגדר את "יחידת האורך" כמיקרומטר. לחץ על "גלובלי" כדי לשמור על ההגדרות ועל "אישור". בחר בחירה אליפסה בסרגל הכלים.
   4. עבור כל צבירה, תחמו את האזור בעזרת הכלי הסגלגל. בחר "נתח | מידה". חשב את הקוטר שלהם בהתבסס על השטח הנמדד, בהתחשב בכך שאגרגטים הם בערך כדוריים באמצעות
      
      עם A כשטח הצבירה.
5. כאשר הקוטר הממוצע של האגרגטים הוא 100 מיקרומטר, החלף 80% מהתווך המושקע ב- mTeSR1 טרי ללא ROCKi. כאשר האגרגטים מגיעים לקוטר של 200–250 מיקרומטר, החליפו את כל המדיום המשומש ב-gfCDM (טבלה 1), והניחו לאורגנואידים להתיישב בתחתית הביוריאקטור.
   הערה: אם הקוטר המצטבר הממוצע עולה על 350 מיקרומטר, אל תתחיל את פרוטוקול ההתמיינות. חזור על הזריעה של תאים בודדים. בדרך כלל, לוקח בערך יום אחד עד שהמצרף מגיע לקוטר ממוצע של 100 מיקרומטר.
6. הכנס את הביוריאקטור המכיל את האגרגטים ליחידת הבסיס האוניברסלית הממוקמת באינקובטור ב 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO₂.
7. הפחת את תסיסה bioreactor ל 25 סל"ד.
8. ביום השני, חזור על שלבים 2.2, 2.3 ו- 2.4 כדי להעריך את הקוטר המצרפי. הוסף 30 μL של FGF2 (ריכוז סופי, 50 ng/mL) ו- 60 μL של SB431542 (ריכוז סופי, 10 μM) ל- 60 מ"ל של מדיום התמיינות gfCDM (טבלה 1). החלף את כל המדיום המשומש מהביוריאקטור עם gfCDM מתווסף. חזור על שלב 2.6.
   הערה: SB431542 חיוני כדי לעכב התמיינות mesendodermal, גרימת התמיינות עצבית. FGF2 משמש לקידום caudalization של רקמת neuroepithelial.
9. ביום החמישי, חזור על שלבים 2.2, 2.3, 2.4 ו- 2.8.
   הערה: הגודל המצטבר אמור לגדול במהלך פרוטוקול הבידול. עם זאת, הקוטר הוא קריטי רק כאשר ההבחנה מתחילה כי פרמטר זה יכול להשפיע על יעילות הדיפרנציאציה.
10. ביום השביעי, חזור על שלבים 2.2, 2.3 ו- 2.4. דילול FGF2 ו-SB431542 ל-2/3: הוסף 20 μL של FGF2 ו-40 μL של SB431542 עד 60 מ"ל של מדיום התמיינות gfCDM. החלף את כל המדיום המושקע מהביוריאקטור בתוספת gfCDM. חזור על שלב 2.6 והגבר את התסיסה של הביוריאקטור ל-30 סל"ד.
11. ביום ה-14, חזור על שלבים 2.2, 2.3 ו-2.4. הוסף 60 μL של FGF19 (ריכוז סופי, 100 ng/mL) ל- 60 מ"ל של מדיום התמיינות gfCDM. החלף את כל המדיום המושקע מהביוריאקטור ב- gfCDM בתוספת FGF19. חזור על שלב 2.6.
    הערה: FGF19 משמש לקידום קיטוב של מבנים באמצע המוח האחורי.
12. ביום ה-18, חזור על שלבים 2.2, 2.3, 2.4 ו-2.11.
13. ביום ה-21, חזור על שלבים 2.2, 2.3 ו-2.4. החלף את כל התווך המושקע מהביוריאקטור בתווך נוירובזאלי מלא (טבלה 1). חזור על שלב 2.6.
    הערה: מדיום נוירובזאלי הוא מדיום בסיסי המשמש לשמירה על אוכלוסיית התאים העצביים בתוך האורגנואיד.
14. ביום ה-28, חזור על שלבים 2.2, 2.3 ו-2.4. הוסף 180 μL של SDF1 (ריכוז סופי, 300 ng/mL) ל- 60 מ"ל של תווך נוירובזאלי מלא. החלף את כל התווך המשומש מהביוריאקטור בתווך נוירובזאלי מלא בתוספת SDF1. חזור על שלב 2.6.
    הערה: SDF1 משמש כדי להקל על הארגון של שכבות תאים נפרדות.
15. ביום ה-35, חזור על שלבים 2.2, 2.3 ו-2.4. החלף את כל המדיום המושקע מהביוריאקטור בתווך BrainPhys מלא (טבלה 1). חזור על שלב 2.6.
    הערה: BrainPhys הוא מדיום עצבי התומך בנוירונים פעילים סינפטית.
16. החלף 1/3 מהנפח הכולל כל 3 ימים בתווך BrainPhys מלא עד ליום 90 של בידול.

טבלה 1: פתרונות מלאי והכנת מדיה. ברשימה מפורטים כל הרכיבים והנפחים המשמשים להכנת מדיה לפרוטוקול התחזוקה והבידול של iPSCs, כמו גם פתרונות מלאי של גורמי גדילה ומולקולות קטנות. עבור פתרונות מלאי, כל ריכוזי המניות והפרוטוקולים להקמה מחדש רשומים.

הכנת מדיה	mTeSR1 נפח סופי: 500 מ"ל	1. הפשירו תוסף mTeSR1 5× בטמפרטורת החדר (RT) או בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה וערבבו עם בינוני בסיסי 2. אחסן mTeSR1 בינוני שלם ב 4 ° C עד שבועיים או להכין 40 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 ° C 3. חימום מראש של mTeSR1 מלא ב-RT לפני השימוש
	gfCDM (מדיום מוגדר כימית ללא גורם גדילה) נפח סופי: 60 מ"ל	30 מ"ל Ham's F12 30 מ"ל IMDM 600 מיקרוליטר תרכיז שומנים מוגדר כימית (1% v/v) 2.4 מיקרוליטר מונותיגליצרול (450 מיקרומטר) 30 מיקרוליטר אפו-טרנספרין (תמיסת מלאי ב-30 מ"ג/מ"ל במים, ריכוז סופי: 15 מיקרוגרם/מ"ל) 300 מ"ג BSA מטוהר התגבשות (5 מ"ג/מ"ל) 42 מיקרוליטר אינסולין (ריכוז מלאי ב-10 מ"ג/מ"ל, ריכוז סופי: 7 מיקרוגרם/מ"ל) 300 מיקרוליטר P/S (0.5% V/V, 50 U/ml פניצילין/50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין)
	Neurobasal נפח סופי: 60 מ"ל	60 מ"ל של Neurobasal בינוני 600 μL N2 תוספת 600 μL Glutamax I 300 μL P/S (0.5% v/v).
	BrainPhys שלם נפח סופי: 60 מ"ל	60 מ"ל של BrainPhys 1.2 מ"ל NeuroCult SM1 תוסף עצבי 600 μL תוסף N2 12 μL BDNF (ריכוז סופי: 20 ng/mL) 12 μL GDNF (ריכוז סופי: 20 ng/mL) 300 μL Dibutyryl-cAMP (ריכוז במלאי: 100 מ"ג/מ"ל במים, ריכוז סופי: 1 mM) 42 μL חומצה אסקורבית (ריכוז במלאי: 50 מיקרוגרם/מ"ל במים, ריכוז סופי: 200 ננומטר)
Stock פתרונות של גורמי גדילה ומולקולות קטנות	גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF/FGF2) ריכוז במלאי: 100 מיקרוגרם/מ"ל	1. לבנות מחדש ב 5 mM Tris, pH 7.6, בריכוז של 10 mg/mL 2. לדלל עם 0.1% BSA ב-PBS (v/v) לריכוז מלאי סופי של 100 מיקרוגרם/מ"ל
	גורם הנגזר מתאי סטרומה 1 (SDF1) ריכוז במלאי: 100 מיקרוגרם/מ"ל	1. יש להרכיב מחדש במים בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל 2. לדלל עם 0.1% BSA (v/ v) ב- PBS לריכוז מלאי סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל.
	גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF) ריכוז במלאי: 100 מיקרוגרם/מ"ל<
	גורם נוירוטרופי הנגזר מתאי גליה (GDNF) ריכוז במלאי: 100 מיקרוגרם/מ"ל
	גורם גדילה פיברובלסט 19 (FGF19) ריכוז במלאי: 100 מיקרוגרם/מ"ל	1. לבנות מחדש 5 mM נתרן פוספט, pH 7.4, בריכוז של 10 מ"ג / mL < br / > 2. לדלל עם 0.1% BSA ב-PBS (v/v) לריכוז מלאי סופי של 100 מיקרוגרם/מ"ל
	מעכב סלעים Y-27632 ריכוז במלאי: 10mM	Rebuild ב- DMSO בריכוז של 10 mM.
	SB431542<בר/> ריכוז במלאי: 10mM
	אינסולין ריכוז במלאי: 10 מ"ג/מ"ל	1. להחזיר 10 מ"ג אינסולין ב 300 μL של 10 mM NaOH 2. מוסיפים בזהירות 1 M NaOH עד שהתמיסה הופכת לברורה-שקופה 3. מלאו עד 1 מ"ל במים סטריליים

טבלה 2: פתרונות להכנת אורגנואידים להקפאה ולאימונוסטיין. ברשימה מפורטים כל המרכיבים והנפחים המשמשים להכנת התמיסות המשמשות להכנת אורגנואידים להקפאה ו immunostaining.

ג'לטין/סוכרוז<בר/> ריכוז סופי: 7.5%/15% w/w

1. שוקלים 15 גרם סוכרוז ו-7.5 גרם ג'לטין בבקבוק זכוכית סטרילי של שוט ומערבבים היטב 2. לחמם מראש את PBS 1× ב 65 ° C < br / > 3. מוסיפים PBS שחומם מראש 1× למשקל סופי של 100 גרם ומערבבים היטב 4. מניחים את בקבוק הזכוכית שוט בצלחת חימום בטמפרטורה של 65°C ומנערים עד שהג'לטין נמס 5. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד לתמיסה מתייצבת

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת BrainPhys Neuronal Medium N2-A ו-SM1	5793 - 500 מ"ל	טכנולוגיה של תאי גזע
תרכיז שומנים מוגדר כימית	11905031	תרמופישר
BSA מטוהר התגבשות	5470	סיגמא
DMEM-F12	32500-035	תרמופישר
סרום בקר עוברי	A3840001	תרמופישר
ג'לטין מעור בקר	G9391	סיגמא
גלוטמקס I	10566-016	תרמופישר
דיבוטיריל cAMP	SC- 201567B -500 מ"ג	פרילאבו
F12 של האם	21765029	תרמופישר
קו iPSC אפיזומלי אנושי	A18945	תרמופישר	iPSC6.2
IMDM	12440046	תרמופישר
אינסולין	91077ג	סיגמא
iPS DF6-9-9T.B		ויסל
איזו-פנטאן	PHR1661-2 מ"ל	סיגמא
L-חומצה אסקורבית	A-92902	סיגמא
מטריג'ל	354230	קורנינג	מטריצת קרום מרתף
מונותיוגיצרול	M6154	סיגמא
mTeSR1	85,850 -500 מ״ל	טכנולוגיות תאי גזע
תוספת N2	17502048	תרמופישר
נוירובזל	12348017	תרמופישר
פרפורמאלדהיד	158127	סיגמא
PBS-0.1 כלי שיט חד-פעמי	מק"ט: IA-0.1-D-001	PBS ביוטק
יחידת בסיס PBS-MINI MagDrive	מק"ט: IA-UNI-B-501	PBS ביוטק
BDNF אנושי רקומביננטי	450-02	פפרוטק
bFGF/FGF2 אנושי רקומביננטי	100-18 ב'	פפרוטק
FGF19 אנושי רקומביננטי	100-32	פפרוטק
GDNF אנושי רקומביננטי	450-10	פפרוטק
SDF1 אנושי רקומביננטי	300-28א	פפרוטק
מעכב רוק	Y-27632 72302	טכנולוגיות תאי גזע
SB431542	S4317	סיגמא
סוכרוז	S7903	סיגמא
תרכובת O.C.T. רקמות-טק	25608-930	VWR