בידוד תאי חיסון חודרי גידול ממוח מוריני

תקציר

מקור: Baker, G. J., et al., Lowenstein, P. R. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (2015)

הסרטון מדגים בידוד של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים חודרי גידול ממוח עכבר באמצעות דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימטי. זה ואחריו צפיפות הדרגתית צנטריפוגה לאסוף את התאים החיסונית לניתוח נוסף.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

הכן תמיסת תערובת מדיה צנטריפוגה בצפיפות על ידי הצבת 90 מ"ל של PBS 10x לתוך 264 מ"ל של מים דה-יוניים טהורים במיוחד (3.93x) במיכל פלסטיק סטרילי. יש לבצע טיטרציה ל-pH 7.0-7.2 עם HCl ולסנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.

הכן מדיית צנטריפוגה בצפיפות 70% על ידי שילוב של 18 מ"ל של תמיסת תערובת מדיה צנטריפוגה בצפיפות עם 30 מ"ל של אמצעי צנטריפוגה בצפיפות (ראה רשימת חומרים לפרטים) בצינור צנטריפוגת פוליפרופילן 50 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C, אך יש להביא ל-RT לפני השימוש.

הכן אמצעי צנטריפוגה בצפיפות 37% על ידי שילוב של 9.6 מ"ל DPBS עם מדיה צנטריפוגה בצפיפות של 10.4 מ"ל 70% בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C, אך יש להביא ל-RT לפני השימוש.

1. בידוד מרכזיות חודרות גליומה

1. באמצעות סכין גילוח נקי, חד צדדי, בודדו את האזור במוח המכיל את הגידול על ידי ביצוע חתך קשתות במרכז המוח כדי לחתוך את שתי ההמיספרות. סובבו את הצד המדיאלי של ההמיספרה האיפסילטרלית כלפי מטה ובצעו שני חתכים קורונליים ברמות המוח הקטן ונורת הריח כדי לבודד את רקמת המטרה שמכילה את השתל הגידולי (איור 1A). חלק מקביל של חצי הכדור הנגדי עשוי גם להיות מבודד ומשמש כבקרה שלילית.
2. הניחו את רקמת המטרה במטחנת רקמת הזכוכית המסומנת בהתאמה המכילה 1 מ"ל של DPBS, דחפו את הבוכנה כל הדרך למטה, וסובבו 7 פעמים כדי לשבש תחילה את הרקמה. הרימו את הבוכנה כדי לאפשר לנוזל לשקוע חזרה לתחתית מטחנת הרקמות. חזור על שלב זה שלוש פעמים; עם זאת, סובב את הבוכנה רק 4 פעמים במהלך שתי החזרות הבאות ו -3 פעמים במהלך החזרה האחרונה כדי למנוע טריטוציה מוגזמת של הרקמה.
3. באמצעות מיקרופיפטה P-1000, יש למרוח ברצף שלושה נפחים של 1 מ"ל של DPBS קרים כקרח לאורך צידי הבוכנה כדי לשטוף לתוך מטחנת הרקמות.
4. השהה מחדש את החומר המוחי המשולש על ידי צנרת למעלה ולמטה והכנסתו לצינור צנטריפוגה מסומן של 15 מ"ל על קרח. שטפו את דפנות מטחנת הרקמות Dounce עם 1 מ"ל נוסף של DPBS קר כקרח והוסיפו לאותו צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. שמור את כל הצינורות המכילים חומר מוחי משולש על קרח עד שכל הדגימות יעובדו.
5. לאחר שכל הדגימות עובדו, סובבו את החומר המוחי המשולש בצינורות הצנטריפוגות של 15 מ"ל בטמפרטורה של 740 x גרם (RCF מקסימלי) למשך 20 דקות ב-4°C.
6. הסר את הסופרנאטנט עם פיפטה סרולוגית 10 מ"ל ואקדח פיפטה והשהה מחדש את חומר המוח הכדורי ב -1 מ"ל של אנזימי העיכול collagenase/DNase-I שהוכנו בעבר באמצעות P-1000. הכניסו את מבחנות הצנטריפוגות בנפח 15 מ"ל למדף מבחנות והכניסו לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות.
7. יש להסעיר בעדינות את הדגימות פעמיים במהלך תקופת הדגירה על ידי הבהוב הצינורות כדי להקל על פירוק הרקמות.
8. הוסף 6 מ"ל של DPBS קר כקרח באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל לכל צינור כדי לדלל את אנזימי העיכול. פיפטה למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש, ולסנן את הנפחים הכוללים באמצעות מסנני רשת ניילון סטריליים של 70 מיקרומטר לתוך צינורות צנטריפוגות חדשים מסומנים 15 מ"ל על קרח.
9. סובבו את תרחיף תאי המוח כלפי מטה ב-740 x גרם (RCF מרבי) במשך 20 דקות ב-4°C כדי להשיג גלולה חד-תאית (איור 1B). לאחר הוצאת צינורות 15 מ"ל מהצנטריפוגה, הניחו אותם על קרח והגדילו את הגדרת הטמפרטורה בצנטריפוגה לכ -21 מעלות צלזיוס לקראת השלב הבא.
10. הסר לחלוטין את הסופרנאטנט מכל צינור המכיל תאי מוח ובתחילה השהה מחדש את הכדוריות ב -1 מ"ל של אמצעי צנטריפוגה בצפיפות של 70% באמצעות מיקרופיפטה P-1000. לאחר מכן הוסף 4 מיליליטר נוספים של אמצעי צנטריפוגה בצפיפות 70% לכל צינור באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. הבריגו היטב את הפקקים והפכו את מתלה התא להומוגני על ידי היפוך עדין לצינורות מספר פעמים.
11. הסר את צינורות הצנטריפוגות בנפח 15 מ"ל המכילות תאי מוח המרחפים מחדש באמצעי צנטריפוגה בצפיפות של 70% מקרח, והכנס למדף מבחנה ב- RT. אחד בכל פעם, שכבו בזהירות 2 מ"ל של תמיסת מדיה צנטריפוגה בצפיפות 37% על 5 מ"ל של מדיית צנטריפוגות בצפיפות 70% עם מיקרופיפטה P-1000 כדי ליצור ממשק נקי בין שתי שכבות המדיה של צנטריפוגות בצפיפות (איור 1C).
    1. השתמש בטוש דק כדי לציין את מיקום הממשק, כך שניתן יהיה לזהות אותו בקלות לאחר צנטריפוגה כאשר ההבחנה הופכת פחות ברורה.
12. סובב את צינורות הצנטריפוגות בנפח 15 מ"ל במהירות 740 x g (RCF מרבי) למשך 20 דקות ב- RT ללא הפסקה כדי למנוע הפרעה לממשק.
13. לאחר הצנטריפוגה, אספו את ה-PBMCs שהצטברו בממשק שבין שתי שכבות המדיה של הצנטריפוגות בצפיפות (איור 1D) על-ידי החדרת מיקרופיפטה P-200 לתוך הצינור לאורך צידו, תוך עקיפת שכבת השומנים.
    1. ברגע שתגיעו לרמה של רצועת PBMC, חלצו באיטיות 200 μl מפני השטח של שכבת המדיה הצנטריפוגית בצפיפות של 70% והניחו אותה בתוך צינור FACS פוליפרופילן מסומן בהתאמה על קרח. חזור על הפעולה פעם אחת לקבלת נפח כולל של 400 μl לדגימה.
14. הוסף 3 מ"ל של חיץ זרימה לכל צינור FACS המכיל 400 μl של PBMCs כדי לדלל במידה מספקת את אמצעי הצנטריפוגה בצפיפות, ולאחר מכן סובב את התאים כלפי מטה ב- 660 x g (RCF מרבי) למשך 20 דקות ב- 4 ° C.

תוצאות

איור 1: בידוד של מרכזיות מרכזיות חודרות גליומה. (A) אסטרטגיה לדיסקציה של רקמת מוח עכבר המכילה שתלי גליומה אורתוטופיים בשלב מוקדם. הלוח העליון מדגים את החתך הסגיטלי של חצי הכדור האיפסילטרלי הרחק מההמיספרה הקונטרלטרלית. הפאנל התחתון מדגים את שני חתכי העטרה הנוספים הדרושים לבידוד רקמת המטרה המכילה את השתל הגידולי (מסומן בסגול). (B) גלולת רקמת מוח חד-תאית (חץ לבן) לאחר ע...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
השינוי של דולבקו למדיום הנשרים	גיבקו	12430-054	עם 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, L-גלוטמין, HEPES 25mM ופנול אדום
מלח חוצץ פוספט של Dulbecco	גיבקו	14190-144	ללא סידן כלורי או מגנזיום כלורי
סרום בקר עוברי	אומגה סיינטיפיק בע"מ	FB-11
פניצילין סטרפטומיצין	גיבקו	15140-122	10,000U / מ"ל פניצילין; 10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין
0.6ml microtubes פוליפרופילן חרוטי	ג'נסי סיינטיפיק	22-272
דלי קרח פוליאוריתן	פישרברנד	02-591-45	קיבולת: 4.5 ליטר (0.152 אונקיות)
Collagenase (סוג I-S)	סיגמא אולדריץ'	C1639	מ Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I	וורת'ינגטון ביוכימיה קורפ	LS002007	>2,000 יחידות קוניץ למ"ג משקל יבש
מספריים גדולים לדיסקציה	טד פלה בע"מ	1316
מספריים קטנים לדיסקציה	FST	14094-11
מלקחיים קהים	טד פלה בע"מ	13250
7 מ"ל זכוכית מקפיצת מטחנת רקמות	קונטס	KT885300-0007
צפיפות פרקול אמצעי צנטריפוגה	GE שירותי בריאות	GE17-0891-01
10 מ"ל פיפטות סרולוגיות	ג'נסי סיינטיפיק	12-104	לשימוש חד פעמי; סטרילי
מסננות תאי רשת ניילון סטריליות 70μm	פישרברנד	22363548
15 מ"ל צינורות צנטריפוגות פוליפרופילן	ג'נסי סיינטיפיק	21-103	תחתית חרוטית
50 מ"ל צינורות צנטריפוגות פוליפרופילן	ג'נסי סיינטיפיק	21-108	תחתית חרוטית
12x75mm פוליפרופילן תחתון עגול FACS צינורות	פישרברנד	14-956-1ב