הסרה סלקטיבית של תאי מיקרוגליה מתרבית נוירונים של גרגיר המוח הקטן של חולדה

תקציר

מקור: Jebelli, J., et al. דלדול סלקטיבי של מיקרוגליה מתרביות תאי גרגיר המוח הקטן באמצעות L-לאוצין מתיל אסטר. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים טכניקה להסרה סלקטיבית של תאי מיקרוגליה מתרבית עצבית ראשונית של חולדות. נוירונים גרגירים cerebellar מטופלים עם antimetabolite לחסל תאי גלייה מתרבים. בנוסף, הם מטופלים בחומרים ממוקדי ליזוזום כדי לרוקן מיקרוגליה מהתרבית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנת כלי נגינה, מדיה תרבותית ומנות

1. הכינו שני מספריים לניתוח מעבדה מנירוסטה ושני מלקחיים מעבדת נירוסטה. Autoclave כל המכשירים ומניחים במכסה מנוע תרבית O/N תחת אור אולטרה סגול (UV) לעיקור.
2. יש לייצר 500 מ"ל של תרבית מדיה חיונית מינימלית (MEM) בינונית (10% סרום בקר עוברי [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCO₃, 30 mM D-גלוקוז, 2 mM L-גלוטמין, 100 U/ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ו 6 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין) ולסנן סטריליזציה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך חודשים.
3. מכינים 24 לוחות תרבית באר המכילים 14 מ"מ, כיסויי עובי מספר 1. יש להלביש את הכיסויים ולצפות בפולי-די-ליזין בנפח 100 מ"ג/ליטר (PDL). אור UV מעקר O/N.

2. הכנת פתרונות תרבית של תאי גרגיר המוח הקטן (CGC)

1. הכינו 'תמיסה A' (100 מ"ל) באוטוקלאב, טיפול באור UV, dH_{סטרילי 2}O המכיל 250 מ"ג גלוקוז, 300 מ"ג אלבומין בסרום בקר [BSA], 955 מ"ג של מלח חוצץ פוספט [PBS] (Ca²⁺ ו- Mg⁺ חינם), ו 1 מ"ל של 3.8% MgSO₄·7H₂O.
2. הכינו 'תמיסה B' (10 מ"ל) המכילה 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל טריפסין מדולל ב-9 מ"ל של תמיסה A.
3. הכינו 'תמיסה C' (10 מ"ל) המכילה 1,000 יחידות DNase, 0.5 מ"ג מעכב טריפסין סויה, 100 μl של 3.8% MgSO₄·7H₂O, מדולל עד 10 מ"ל עם תמיסה A.
4. מכינים 'תמיסה D' (20 מ"ל) המכילה 3.2 מ"ל של תמיסה C, מדוללת ל 20 מ"ל עם תמיסה A.
5. הכינו את תמיסת המלח המאוזנת (EBSS) של BSA/ארל המכילה EBSS, 25 mM NaHCO₃, 3 mM MgSO₄·7H₂O, ו-4% BSA, pH 7.4.
6. הכן L-לאוצין מתיל אסטר (LME) על ידי הוספת LME טהור לתוך 5 מ"ל של מדיום תרבית MEM כדי לתת ריכוז סופי של 150 mM LME, להחזיר את התמיסה ל- pH 7.4 באמצעות מד pH benchtop, ולסנן סטריליזציה באמצעות מסנן מזרק 28 מ"מ פוליאתר סולפון (PES) 0.2 מיקרומטר.

3. טיפוח ה-CGCs

1. אספו צרבלה מגורי חולדות בני 4-7 ימים. מניחים מיד בצלחת פטרי המכילה 5 מ"ל תמיסה A על קרח.
2. יוצקים את התמיסה העודפת מהצרבלה ומניחים את הרקמה במכסה צלחת הפטרי.
3. קוצצים רקמות דק עם סכין גילוח להבה היטב לפחות בשלושה כיוונים שונים.
4. הוסיפו רקמה קצוצה לתמיסה B (שטפו את צלחת הפטרי בתמיסה כדי להבטיח אובדן רקמה מוגבלת) והכניסו לאמבט המים בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. נערו בעדינות כל כמה דקות.
5. הוסף תמיסה D (20 מ"ל) לצינור כדי לנטרל את הטריפסין, לנער ולצנטריפוגה ב 65 x גרם במשך 5 דקות.
6. לשפוך את supernatant.
7. השהה ב 4 מ"ל של פתרון C. Triturate היטב (כ 10 פעמים כל אחד) עם שלוש פיפטות זכוכית להבה בקוטר יורד, עד ההשעיה הוא הומוגני ככל האפשר.
8. הוסיפו לאט ובעדינות כמה טיפות של הומוגנט זה על גבי BSA/EBSS. אם הוא מתחיל לשקוע דרך BSA/EBSS, שלשו יותר ו/או הוסיפו עוד קצת תמיסה C. ההומוגנט צריך לשבת בשכבה על גבי BSA/EBSS. אין לרעוד. סחרור ב 100 x גרם במשך 5 דקות.
9. מוציאים את הסופרנאטנט ומשעיפים מחדש את הגלולה (רכה) ב-1 מ"ל של מדיום MEM.
10. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר וצלחת ב 800,000 תאים / coverslip ב 500 μl של מדיום MEM. מניחים באינקובטור ב 37 °C עם 6% CO₂.
11. שנה את המדיום למחרת (24-36 שעות לאחר ההכנה). הפוך תמיסה של מדיום MEM המכיל 10 מיקרומטר של מעכב מחזור התא arabinofuranosyl cytidine (AraC).
    1. עבור כל כיסוי, שמרו 250 μl של המדיום הישן בצלחת טרייה של 24 בארות, שאפו את השאר, הוסיפו 250 μl של מדיום MEM רגיל, ושאפו זאת כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן, הוסף את 250 μl של המדיום הישן בחזרה לתאים וממלא עם 250 μl של מדיום המכיל AraC.
       הערה: תאים ניתן להשתמש מ 6 ימים במבחנה (DIV).

4. דלדול סלקטיבי של תאי מיקרוגליה (מבוצע ב 6 DIV)

1. הוסף LME טהור ל 5 מ"ל של aliquot נפרד של מדיום MEM כדי לתת ריכוז סופי של 150 mM LME.
2. החזר את התמיסה ל- pH 7.4 וסנן חיטוי באמצעות מסנן מזרק 28 מ"מ פוליאתר סולפון (PES) 0.2 מיקרומטר.
3. יש לדלל תמיסה לריכוז של 50 mM (2 x LME) בתווך MEM ולהניח באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות יחד עם מדיום MEM רגיל לתרביות ביקורת.
4. הסר מחצית (250 מיקרוליטר) מתווך MEM מתרביות CGC ושמור על 37 ° C.
5. יש לטפל בתאים עם מדיום MEM המכיל 2 x LME (250 μl), כלומר 1:1 מדולל הנותן ריכוז באר של 25 mM, או עם מדיום MEM שחומם מראש ללא LME (250 μl) עבור תרביות ביקורת.
6. לדגור על תאים בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה עם 6%_CO2 למשך שעה אחת.
7. שטפו תאים פעמיים בתווך MEM טרי שחומם מראש כדי להסיר מדיה המכילה LME, ולאחר מכן החליפו את מדיום התרבית שנשמר ונפח שווה של מדיום MEM טרי שחומם מראש לבארות המתאימות.
8. יש להחזיר תרביות לאינקובטור (לחות עם 6% CO₂ ב-37°C) ולהשאיר לנוח 24 שעות לפני כל טיפול נוסף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלקחיים	סיגמא-אולדריץ'	F4142	הקצה המעוגל מאפשר את הסרת המוח הקטן
מספריים לניתוח זעיר	סיגמא-אולדריץ'	S3146	נקודה ישרה וחדה מאפשרת דיסקציה של מכרסם P4-7
L-לאוצין מתיל אסטר הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	7517-19-3
פתרון EBSS	סיגמא-אולדריץ'	E7510-500 מ"ל
פולי-די-ליזין	סיגמא-אולדריץ'	27964-99-4	כיסויי מעיל יום אחד לפני השימוש
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא-אולדריץ'	A9418
מלח חוצץ פוספט (PBS)	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 4417
דנאז	סיגמא-אולדריץ'	D5025
מעכב טריפסין סויה	סיגמא-אולדריץ'	T6414