הפרוטוקול למיצוי רקמת המוח מהיום הראשון גורי חולדות Sprague Dawley, שהומתו על ידי עריפת ראש, אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אלברטה.
1. בידוד מיקרוגליה ואסטרוציטים
הערה: כל המדיה לבידוד ותרבית תאים מחוממת מראש ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים. תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) מכילה 1% פניצילין-סטרפטומיצין (PS). כל המדיה המעובדת של Eagle's Eagle's עם תערובת החומרים המזינים F12 של Ham (DMEM/F12) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (PS). רק תערובות עם טריפסין חוסר FBS. כל החומרים בפרוטוקול זה הם סטריליים (פילטר, אלכוהול, קנוי ואוטומטי) וכל שלב לאחר שלב מספר 1.8 מבוצע בארון בטיחות ביולוגית בטכניקה אספטית.
- לכל מוח, חימום מראש של 15 מ"ל HBSS ו-12.5 מ"ל DMEM/F12 עד 37°C בצינורות צנטריפוגות חרוטיות של 50 מ"ל, וכ-2 מ"ל של 0.25% טריפסין עם 1 mM אתילאנדיאמיןטטראצטי חומצה (EDTA) בצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מ"ל. יש לחמם 25 מ"ל נוספים של DMEM/F12. יש לחמם את הטריפסין כ-10 דקות לפני השימוש כדי למנוע אובדן פעילות אנזימטית.
- יוצקים מספיק HBSS חם לתוך כלים סטריליים, 6 ו 10 ס"מ תרבית כדי לכסות את פני השטח. הכינו מנה אחת בקוטר 10 ס"מ על כל שני מוחות ועוד 6 ס"מ מנה.
- מקמו עד 2 מוחות בכל צלחתבגודל 10 ס"מ (איור 1A).
- תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו במלקחיים מעוקלות וישרות כדי להפריד בין קליפת המוח לאורך קו האמצע, לבין המוח הקטן עם גזע המוח. זה מניב שלושה מקטעים של רקמה בכל מוח (איור 1B).
- מקלפים את השכבה הדקה, השקופה למחצה, (קרומי המוח) של הרקמה המכילה כלי דם מכל חלק של הרקמה ומשליכים, מעבירים את הרקמה הנותרת לצלחת תרבית נפרדת. אחזו בשכבות הדקות החשופות על ידי חתכי הרקמה, בעזרת המלקחיים, ומשכו בזהירות עד שחלקים גדולים "תלויים" ברקמת המוח. לבסוף להסיר את החלק הזה על ידי משיכה עדינה. ראו איור 1C-1E לקבלת תמונות מייצגות של לפני, במהלך ואחרי השלב הזה.
- בארון בטיחות ביולוגית, הסר את HBSS שנותר מצלחת התרבית, תוך שמירה קפדנית על הרקמה. Macerate את הרקמה עם אזמל ולהעביר רקמה לצינור 15 מ"ל שחומם מראש עם טריפסין.
- דגרו על צינור זה במשך 25 דקות באמבט של 37 מעלות צלזיוס כדי לעכל את הרקמה באופן אנזימטי.
- צנטריפוגו את הצינור ב 500 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, ושפכו החוצה את supernatant.
- באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף 10 מ"ל של DMEM/F12 חם כדי להשבית את הטריפסין ולשלש את התמיסה 5 פעמים כדי לפרק את הרקמה.
- צנטריפוגו את הצינור ב 500 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, ושפכו החוצה את supernatant.
- באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, יש להשהות מחדש את הגלולה לתוך 10 מ"ל של DMEM/F12 חם ולהעביר את התמיסה לצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מ"ל.
- באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט 18 מד, triturate את הפתרון 3 פעמים.
- חלק תמיסה זו למרווחים של 12.5 מ"ל DMEM/F12 חם לכל מוח.
- פיפטה 1 מ"ל מרווחים של התמיסה triturated לתוך צלחת 12 באר (1 לכל מוח).
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 באינקובטור תרביות תאים לחות. החלף מדיה לאחר שלושה ימים, ורענן מדיה כל שלושה ימים לאחר מכן. לאחר שבועיים, ניתן לאסוף את התאים לניסויים.
2. סינתזת מאקרומרים
- שוקלים 375 מ"ג מלח חומצה היאלורונית (HA) בצינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל ומוסיפים 37.5 מ"ל מים מזוקקים.
- שוטפים את התמיסה במערבולת למשך דקה אחת ומפעילים את התערובת עד שהיא נראית הומוגנית ומאבדת את צמיגותה דמוית הג'ל. תהליך זה עשוי להימשך 6 שעות.
- מעבירים את התמיסה לכוס של 100 מ"ל עם מוט ערבוב מגנטי (38 מ"מ), ומערבבים נמרצות בטמפרטורת החדר.
- הכניסו בזהירות 5.0 M NaOH לתוך HA הערבוב ומדדו עם נייר pH עד שה-pH מתייצב בין 8 ל-12.
- יש לאסוף 3 מ"ל של אנהידריד מטאקרילי טרי (MA, 94%), מכוסה בחנקן במהלך האחסון.
הערה: MA חשוף לאטמוספירה לפרקי זמן ארוכים (ימים), הוא יאבד את תגובתיותו.
זהירות: כל שימוש בתואר שני צריך להיעשות במכסה אדים.
- הוסף 200 μL של MA לתמיסת הערבוב HA. התגובה מורידה את רמת החומציות של התמיסה מתחת ל-8.
- חזור על שלבים 2.4 עד 2.6 עד להוספת 3 מ"ל של MA לפתרון. תהליך זה עשוי להימשך עד 1-2 שעות.
- אפשר לתגובה להמשיך לילה ב 4 ° C, ללא ערבוב.
- להעביר פתרון 400 מ"ל של אתנול קר (EtOH) בכוס 500 מ"ל ולאפשר משקעים במשך 24 - 72 שעות ב 4 °C (75 °F).
- בזהירות decate את החלק העיקרי של הפתרון לתוך נפרדת לסילוק, ולאסוף את המשקע בצינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל. זה עשוי להיות מופץ 2-4 צינורות, במידת הצורך.
- צנטריפוגה את הצינורות ב 200 x גרם בצנטריפוגה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר להיפטר supernatant.
- ממלאים את הצינור ב-EtOH קר, מערבבים את התמיסה עם מערבולת למשך דקה אחת, וחוזרים על שלב 2.10-2.11.
- מוסיפים 25 מ"ל מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה, מערבבים את התמיסה עם מערבולת למשך דקה אחת, סוניקטים (>20 קילוהרץ) למשך שעה אחת ודגרים ב-4°C למשך הלילה.
- הכניסו את התמיסה למקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך 15 דקות או עד להקפאה או להקפאת הבזק בחנקן נוזלי.
זהירות: בעת שימוש בחנקן נוזלי, השתמש בכפפות מגן, מגן פנים וסינר.
- יש לייבש בהקפאה את הצינור (מתחת ל-0.1 mBar ו-30°C) למשך 24 - 48 שעות עד לקבלת אבקה דמוית שלג.
- בשלב זה, בדוק את הדגימה לטוהר באמצעות תהודה מגנטית גרעינית של 1H, שבה ניתן לאשר את כמות פרוטוני המתקרילט (שיא של 6.1 ו- 5.6 ppm), ביחס לפרוטוני מתיל (1.9 ppm), בעמוד השדרה של HA. יחס מינימלי של 95% מתקרילט לפרוטוני מתיל מקובל.
3. היווצרות ג'ל ואנקפסולציה תלת-ממדית
- הכנת כיסויים ועובש
- צור תמיסת מים מזוקקים 50 מ"ל של 2% 3-(Trimethoxysilyl) פרופיל מתקרילט בצינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל.
- הניחו את כיסויי הזכוכית בקוטר 18 מ"מ בתמיסה והתנדנדו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. ניתן להוסיף עד 50 כיסויים בבת אחת.
- יש לשטוף את הכיסויים על ידי טבילה סדרתית של כל אחד מהם ב-3 כוסות של 100 מ"ל מים נטולי יונים.
- יבשו את הכיסויים בוואקום בטמפרטורה של 40°C למשך הלילה עם מייבש ותנור.
- טבול במהירות כיסויים בודדים ב-70% EtOH עם מלקחיים.
- ללא ייבוש, יש לזרוק כל מכסה לבאר של צלחת בת 12 בארות.
- לשטוף ולשאוף כל באר עם מים סטריליים deionized (1 מ"ל לכל באר).
- הוסף 1 מ"ל של פולי-L-ליזין סטרילי 2 מיקרוגרם / מ"ל (PLL) לכל באר ודגר במשך >2 שעות.
- שאפו תמיסת PLL ואפשרו לכיסויים להתייבש באוויר.
- טבלו תבניות פולידימתיל סילוקסאן (PDMS) (ראו איור 2) ב-70% EtOH, הניחו אחת מהן במרכז כל כיסוי, ואפשרו להן להתייבש באוויר וליצור אטימה בין התבנית לזכוכית.
- הכינו תבניות PDMS על ידי יציקת ריאגנטים של PDMS premix ביחס של 10:1 בצלחת פוליסטירן בעלת תחתית שטוחה. כמות PDMS מוכנה נבחרת כדי להניב יריעה בעובי של כ -1 מ"מ. כדי ליצור בארות ב PDMS, לחתוך את הסדינים עם אגרוף מעגל עם קוטר פנימי של 10.
- הכנת תאים
הערה: כל השלבים בפרוטוקול מבוצעים בטכניקה סטרילית בארון בטיחות ביולוגית. תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) מותאמת ל- pH 7.4 עבור כל השלבים.
- 24 שעות לפני אנקפסולציית תאים בחומצה היאלורונית מתקרילטית (HAMA), יש לרענן את המדיום לתרביות הראשוניות של שבועיים (משלב 1.15) ב-12 לוחות הבאר. הוסף 1 מ"ל DMEM/F12 (10% FBS ו-1% PS) בינוני לכל באר.
- עבור כל צלחת 12 בארות של תאים להכין 12.5 מ"ל של טריפסין מדולל (0.25% טריפסין-EDTA מדולל 30% עם מדיה DMEM/F12), ו 25 מ"ל DMEM/F12 (10% FBS ו 1% PS) ולחמם ב 37 ° C באמבט מים.
- יש לאסוף תווך מותנה מהצלחות באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל (> 0.5 מ"ל לבאר), לשאוף היטב את שאריות הנוזל ולהחליף ב-1 מ"ל לבאר טריפסין מדולל (0.075% טריפסין-אתילאנדיאמיןטטראצטי חומצה [EDTA]) למשך 20-30 דקות באינקובטור (37°C, 5% CO2) עד ששכבת התא המתמזגת מתנתקת מהצלחת.
- לשחזר חומר תא תלוי עם פיפטה 1 מ"ל (מופיע כחתיכה צפה אחת) ולאסוף בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל. לדלל עם נפח שווה ערך של DMEM/F12 (10% FBS ו 1% PS), וצנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, לזרוק את supernatant.
- להשהות מחדש את גלולת התא ב 10 מ"ל חם DMEM/F12 (10% FBS ו 1% PS), triturate את התאים 5 פעמים עם פיפטה 10 מ"ל, צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 2 דקות.
- דקרו את הסופרנטנט, השהו מחדש את התאים ב-5 מ"ל DMEM/F12 חם, והעבירו את התאים לצינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל.
- באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט 18 מד, triturate את תמיסת התא 3 פעמים, ולסנן את המתלה דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי חדש.
- אספו 10 μL של תרחיף תאים, דללו 1:100 ב-DMEM/F12 חם וספרו תאים עם מונה תאים אוטומטי.
- יש לדגור באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לשלב הכימוס.
- אנקפסולציה של תאים
הערה: כל השלבים בפרוטוקול מבוצעים בטכניקה סטרילית בארון בטיחות ביולוגית.
- עבור כל צלחת 12 בארות של הידרוג'ל תלת ממדי חם 12.5 מ"ל של DMEM/F12 ו 12.5 מ"ל של מדיה ממוזגת DMEM/F12 שנאספו במהלך הכנת התא.
- לשקול את כמות HAMA הדרושה לריכוז סופי של 0.5% wt/vol. להמיס HAMA זה ב-PBS מסונן סטרילי בריכוז של (2% wt/vol); ריכוז הגבוה פי 4 מהריכוז הסופי מנוצל לתוספת תאים וריאגנטים אחרים. צלחת אחת של 12 בארות של הידרוג'לים דורשת ~ 350 μL PBS עם 7 מ"ג HAMA.
- פתרונות Sonicate (>20 kHz) עד להמסה מלאה של HAMA למשך 60 דקות.
- הכינו תמיסות בודדות של 10% הן של טריאתנולאמין (TEA) והן של 1-ויניל 2-פירולידינון (NVP), ותמיסה של 1 mM של Eosin Y (EY) ב 1 מ"ל aliquots של PBS pH סטרילי 7.4.
- עבור צלחת אחת של 12 בארות, הכינו תערובת סופית של 1.4 מ"ל של 1 x 107 תאים, 0.5% wt/vol HAMA (350 μL של 2% wt/vol), 0.1% TEA (14 μL של 10%), 0.1% NVP (14 μL של 10%) ו-0.01 mM EY (14 μL של 1 mM), ו-20% תערובת למינה בסיסית (280 μL של מלאי). הכרך הנותר הוא PBS.
- מערבבים בעדינות את התמיסה ואת פיפטה 100 μL לתוך כל תבנית PDMS עם קצה 1 מ"ל.
- חשוף דגימות לאור LED ירוק בעוצמה גבוהה (~ 520 ננומטר, 60 mW, בקופסה סגורה בגודל 20 ס"מ x 20 ס"מ x 20 ס"מ) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 1 מ"ל לכל באר של DMEM/F12 ממוזג חם לצלחת 12 בארות.
- אוחזים בכל כיסוי בין האגודל לאצבע, מקלפים לאט את תבנית ה-PDMS בפינצטה מעוקלת נזהרים שלא להזיז את הג'ל ומניחים אותו בבאר עם תווך מותנה.
- הוסף 1 מ"ל DMEM/F12 חם נוסף לכל באר.
- לדגור על צלחות ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך שבועיים, רענון מדיה התא כל שבוע על ידי pipeting 1 מ"ל של מדיה מכל באר ולהחליף עם 1 מ"ל DMEM/F12.
