$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. תרבית תאים והכנת מגיבים
- מכינים צלחות מצופות לתרבית תאים.
- יש לדלל את תמיסת הציפוי של מטריצה חוץ-תאית (ECM) במדיית DMEM/F12 להכנת תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל. Aliquot את פתרון מלאי ECM מדולל לתוך 30 צינורות חרוטיים של 3 מ"ל כל אחד ומיד לאחסן ב -20 ° C. לפתרון עבודה, השהה מחדש 3 מ"ל של מלאי ECM ל- 33 מ"ל של מדיה DMEM/F12 מקוררת מראש, והביא את הנפח הכולל ל- 36 מ"ל לריכוז של 80 מיקרוגרם / מ"ל.
- מעיל 1 מ"ל לכל באר של צלחת תרבית תאים 6 בארות עם פתרון עבודה ECM. הוסף 1 מ"ל DMEM/F12 נוספים לכל באר (במידת הצורך) כדי להבטיח שפני השטח של הבאר מכוסים במלואם. אפשר לצלחות תרבית התאים המצופות 6 בארות לשבת בטמפרטורת החדר לפחות שעה אחת לפני השימוש.
הערה: ניתן לאחסן לוחות מצופים באינקובטור או בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
- הכינו פורמולציות מדיה, גורמי גדילה ומולקולות קטנות.
- כדי להכין 500 מ"ל של תווך תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC), הוסף תוספי 20x ו- 500x בהתאם להוראות היצרן.
- כדי להכין 500 מ"ל של מדיום עצבי (NM), להוסיף הפרין לריכוז סופי של 2 מ"ג / מ"ל, 1x של פתרון אנטיביוטי/אנטי-מיקוטי, 1x תוסף B27 או 1x תוסף N2 לבקבוק 500 מ"ל של DMEM/F12 עם תוסף L-גלוטמין כפי שפורט קודם לכן.
- להכנת תמיסת מלאי של 10 מילימטר (1,000x) של מעכב רו-קינאז Y27632 (Y), יש להוסיף 10 מ"ג אבקה ל-3 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS). יש לסנן, לעקר, ליצור aliquot ולאחסן בטמפרטורה של -20°C. יש להשתמש בריכוז עבודה של 10 מיקרומטר במדיה.
- להכנת תמיסת מלאי של 20 מ"מ (10,000x) של SB431542, יש להוסיף 10 מ"ג אבקה ל-1.3 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO). להכנת תמיסת מלאי של 2 מ"מ (1,000x) של DMH1, יש להוסיף 10 מ"ג אבקה ל-13.1 מ"ל DMSO. סינון, עיקור, aliquot, ולאחסן כל פתרון ב -20 ° C. יש להשתמש בכל תמיסה בריכוז עבודה של 2 מיקרומטר במדיה (NM + SB431542 + DMH1).
הערה: פרוטוקול זה ממליץ על ריכוזי עבודה של 2 מיקרומטר הן של SB431542 והן של DMH1 בהתבסס על התצפיות שלנו ודיווחים מאחרים הקובעים כי ריכוז זה מקדם ביעילות אינדוקציה עצבית מתאי גזע גזעיים גזעיים. כמו כן דווח על ריכוזים גבוהים יותר30. בנוסף, עם מדיה חלופית, הוכח גם כי מולקולות קטנות אינן נחוצות להמרה עצבית גבוהה. לפיכך, ריכוזי העבודה ישתנו בהתאם לסביבות תרבית תאים חלופיות, וריכוזים אופטימליים צריכים להיבדק על ידי חוקרים בודדים.
- כדי להכין תמיסות מלאי בודדות של 100 מיקרוגרם/מ"ל (10,000x) של גורם גדילה אפידרמלי (EGF) וגורם גדילה פיברובלסטי-2 (FGF2), יש להוסיף 1 מ"ג מכל אחד מהם ל-10 מ"ל PBS + 0.1% BSA. Aliquot EGF ו- FGF2 תמיסות מלאי לתוך 50 μL aliquots ולאחסן ב -80 ° C. להשתמש בכל אחד מהם בריכוז עבודה של 10 ננוגרם/מ"ל במדיה; לדוגמה, הוסף 5 μL EGF ו- 5 μL FGF2 עד 50 מ"ל של NM (NM + EGF + FGF2).
- כדי להכין תמיסת מלאי של דוקסיציקלין הידרוכלוריד (Dox), יש להמיס תחילה אבקה ב-DMSO ל-100 מ"ג/מ"ל ולאחסן בטמפרטורה של -20°C. יתר על כן, לדלל אותו כדי ליצור תמיסת מלאי של 2 מ"ג / מ"ל (1,000x) ב- PBS ולאחסן ב -20 ° C. יש להשתמש בריכוז עבודה של 2 מיקרוגרם/מ"ל במדיה; לדוגמה, הוסף 50 μL Dox ל- 50 מ"ל של NM (NM + Dox).
הערה: אין להקפיא מחדש את התמיסות לאחר ההפשרה.
2. יצירת תת-סוגים עצביים מתאים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hPSCs)
הערה: כל תרביות התאים צריכות להישמר באינקובטור עם 5% CO2 ב 37 ° C. תרביות אלה נשמרות ברמות חמצן בחדר, אם כי ניתן להשתמש ברמות נמוכות יותר.
- צור ותחזק אבות אסטרוציטים (hAstros) מ- hPSCs.
הערה: סעיף זה מספק פרוטוקול בידול קצר ופשוט. לתיאור מפורט (עם היווצרות גוף עוברי, בחירת רוזטה ושלבי דפוסים אזוריים), עיינו בפרוטוקול שתואר קודם לכן (איור 1A, תיבה ירוקה מנוקדת).
- אשכולות זרעים של hPSCs (איור 1B) על לוחות 6 בארות מצופי ECM (ראו שלב 1.1) עם 2 מ"ל של hPSC בינוני + Y לכל באר. יש להאכיל את תאי הגזע מדי יום עד שהם מתלכדים בכ-50% ומתפצלים לפי הצורך.
- כדי לפצל hPSCs, הוסף 1 מ"ל של מגיב עובר לבארות ולשאוף לאחר 1 דקה. לדגור על תאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, להוסיף 1 מ"ל של hPSC בינוני, ולפצל אגרגטים 1:10 על בארות מצופות ECM חדשות ב 2 מ"ל של hPSC בינוני + Y לכל באר.
- שמור על תאי הגזע עד שהם כ 50% confluent, ולאחר מכן לשנות מדיה NM + SB431542 + DMH1 כדי לגרום התמיינות עצבית (יום 0). כאשר התאים נפגשים בכ-95%, יש לפצל ביחס של 1:6 לבארות חדשות מצופות ECM באותו תווך.
- ביום ה -14, נתקו את התאים עם תמיסת הניתוק והעבירו אותם לבקבוק לא מצופה עם Y כדי לקדם את היווצרות האגרגטים.
הערה: התוספת של Y משמשת לקידום הישרדות התא ויצירת כדורים, אך אינה נכללת במהלך כל הזנה.
- עבור הדור של אבות עצביים ונוירונים (hNeurons), להשתמש אלה יום 14 תאים כמתואר להלן. לחלופין, השתמש בתאים אלה בנקודות זמן מאוחרות יותר מתרביות חד-שכבתיות או כדוריות לפני שמתרחשת הבשלה עצבית או גליוגנזה מתחילה.
הערה: כברירת מחדל, פרוטוקול זה מייצר אסטרוציטים גביים-קורטיקליים. עם זאת, ניתן להגדיר תת-סוגים של אסטרוציטים באופן אזורי על ידי הוספת מורפוגנים בעלי תבניות במידת הצורך. חומצה רטינואית (RA) עשויה להיות מוסיפה כדי להפוך תאים לפנוטיפים של חוט השדרה, בעוד שקיפוד קולי (SHH), אגוניסט מוחלק (SAG) או פורמורפמין ייצרו פנוטיפים גחונים.
- ליצירת אבות אסטרוציטים ואסטרוציטים בצברים תלת-ממדיים שנוצרו באופן ספונטני (hAstrospheres), עברו ל-NM + EGF + FGF2 והזינו מדי שבוע (או לפי הצורך כדי להבטיח pH יציב) כפי שפורט קודם לכן.
- נתקו בעדינות את אגרגטי hAstro עם תמיסת ניתוק כאשר מופיעים מרכזים כהים והוציאו כדורים המתחברים באופן ספונטני. שברו כדורים בעדינות פעם בשבוע כדי לשמור על בריאות הכדור ולהימנע מליבות נמקיות.
הערה: אין לחרוג מ-5 דקות טיפול בתמיסת ניתוק.
- לאחר 4-6 חודשים של הרחבה, יש לאשר את זהות התא ולהקפיא באמצעי שימור בהקפאה (בהתאם להוראות היצרן) או בתנאי אחסון חלופיים לשימור ארוך טווח בחנקן נוזלי או להשתמש מיד לניסויים.
