יצירה ותחזוקה של אסטרוספירות באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

תקציר

מקור: Cvetkovic, C., et al. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (2018).

הסרטון מדגים שיטה ליצירת אסטרוספירות מאבות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. זה כרוך בצמיחה והתפשטות של תאי גזע עם מדיה תזונתית המכילה גורמי גדילה ומעכבי קינאז. תאים אלה מצטברים ומתמיינים לאסטרוציטים, ויוצרים אסטרוספירות.

פרוטוקול

1. תרבית תאים והכנת מגיבים

1. מכינים צלחות מצופות לתרבית תאים.
   1. יש לדלל את תמיסת הציפוי של מטריצה חוץ-תאית (ECM) במדיית DMEM/F12 להכנת תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל. Aliquot את פתרון מלאי ECM מדולל לתוך 30 צינורות חרוטיים של 3 מ"ל כל אחד ומיד לאחסן ב -20 ° C. לפתרון עבודה, השהה מחדש 3 מ"ל של מלאי ECM ל- 33 מ"ל של מדיה DMEM/F12 מקוררת מראש, והביא את הנפח הכולל ל- 36 מ"ל לריכוז של 80 מיקרוגרם / מ"ל.
   2. מעיל 1 מ"ל לכל באר של צלחת תרבית תאים 6 בארות עם פתרון עבודה ECM. הוסף 1 מ"ל DMEM/F12 נוספים לכל באר (במידת הצורך) כדי להבטיח שפני השטח של הבאר מכוסים במלואם. אפשר לצלחות תרבית התאים המצופות 6 בארות לשבת בטמפרטורת החדר לפחות שעה אחת ....

תוצאות

איור 1: תיאור הדרגתי של התמיינות והיווצרות של ספירות עצביות תלת-ממדיות הנגזרות מ-hPSCs. (א) ציר הזמן של שלבי מפתח בפרוטוקול. (B) אוכלוסיות טהורות של תאים עצביים יכולות להיווצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hPSCs). ליצירת אבות אסטרוציטים (קופסה ירוקה מנוקדת), ראה שלב 2.1. (C) נוירונים מושרים (iNeurons; ראה סעיף 2.2) הנוצרים מתאי גזע גזעיים טרנסגניים באמצעות ביטוי יתר מושרה של נוירוגני.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
6 צלחת באר	פישר סיינטיפיק	08-772-1B
15 מ"ל צינורות חרוטיים	אולימפוס פלסטיק	28-101
אקוטאזה	סיגמא	A6964-100ML	פתרון ניתוק
צלחת AggreWell	טכנולוגיות תאי גזע	34850
תמיסת שטיפה נגד היצמדות	טכנולוגיות תאי גזע	7010	מניעת הידבקות תאים לצלחות מיקרו-באר
אנטי/אנטי	תרמופישר	15240062
B27	תרמופישר	17504044	מוסף מדיה
BrainPhys מדיום עצבי	טכנולוגיות תאי גזע	5790	חלופה נוירופיזיולוגית בינונית בסיסית
קריוסטר CS10	טכנולוגיות תאי גזע	7930	אמצעי שימור בהקפאה עם 10% DMSO
DMEM/F12	תרמופישר	10565-042	עם תוסף GlutaMAX
DMH-1	טכנולוגיות תאי גזע	73634	סכנה: רעיל בבליעה. ריכוז עבודה: 2 uM
דוקסיציקלין הידרוכלוריד (Dox)	סיגמא	D3072-1 מ"ל	סכנה: רעיל לנשים בהריון. ריכוז עבודה: 2 ug / mL
גורם גדילה אפידרמיס (EGF)	פפרוטק	AF-100-15	ריכוז עבודה: 10 ng/mL
גורם גדילה פיברובלסט-2 (FGF)	פפרוטק	100-18 ב'	ריכוז עבודה: 10 ng/mL
Hemacytometer או מונה תאים אוטומטי	לייף טכנולוגיות	AMQAX1000
מטריצת קרום מטריג'ל	קורנינג	354230	פתרון ציפוי ECM. ריכוז עבודה: 80 מ"ג / מ"ל. הכינו על קרח וודאו שהפיפטה, הצינורות והמדיה מקוררים מראש.
פתרון הרכבה
N2	תרמופישר	17502048	מוסף מדיה
מלח חוצץ פוספט (PBS)	טכנולוגיות תאי גזע	CA008-300
ReLeSR	טכנולוגיות תאי גזע	5872	ניתוק ומגיב עובר
מעכב רו-קינאז Y27632- (Y)	טוקריס	1254	ריכוז עבודה: 10 uM
SB431542	טכנולוגיות תאי גזע	72234	ריכוז עבודה: 2 uM
בקבוק תרבות T25	אולימפוס פלסטיק	25-207	מכסים מאווררים
T75 תרבות בקבוק	אולימפוס פלסטיק	25-209	מכסים מאווררים