$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
אישורים אתיים התקבלו בעת ביצוע הניסויים.
1. תרבית תאים והכנת מגיבים
- מכינים צלחות מצופות לתרבית תאים.
- תמיסת ציפוי מטריצה חוץ-תאית מדוללת (ECM) עם מדיית תערובת F-12 (DMEM/F12) של Dulbecco להכנת תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל. Aliquot את פתרון מלאי ECM מדולל לתוך 30 צינורות חרוטיים של 3 מ"ל כל אחד ומיד לאחסן ב -20 ° C. לפתרון עבודה, השהה מחדש 3 מ"ל של מלאי ECM ל- 33 מ"ל של מדיה DMEM/F12 מקוררת מראש, והביא את הנפח הכולל ל- 36 מ"ל לריכוז של 80 מיקרוגרם / מ"ל.
- מעיל 1 מ"ל לכל באר של צלחת תרבית תאים 6 בארות עם פתרון עבודה ECM. הוסף 1 מ"ל DMEM/F12 נוספים לכל באר (במידת הצורך) כדי להבטיח שפני השטח של הבאר מכוסים במלואם. אפשר לצלחות תרבית התאים המצופות 6 בארות לשבת בטמפרטורת החדר לפחות שעה אחת לפני השימוש.
הערה: ניתן לאחסן צלחות מצופות באינקובטור או בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
- הכינו פורמולציות מדיה, גורמי גדילה ומולקולות קטנות.
- כדי להכין 500 מ"ל של תווך תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC), הוסף תוספי 20x ו- 500x בהתאם להוראות היצרן.
- כדי להכין 500 מ"ל של מדיום עצבי (NM), להוסיף הפרין לריכוז סופי של 2 מ"ג / מ"ל, 1x של פתרון אנטיביוטי/אנטי-מיקוטי, 1x תוסף B27 או 1x תוסף N2 לבקבוק 500 מ"ל של DMEM/F12 עם תוסף L-גלוטמין כפי שפורט קודם לכן.
- להכנת תמיסת מלאי של 10 מילימטר (1,000x) של מעכב רו-קינאז Y27632 (Y), יש להוסיף 10 מ"ג אבקה ל-3 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS). יש לעקר ולסנן בטמפרטורה של -20°C. יש להשתמש בריכוז עבודה של 10 מיקרומטר בחומרי הדפסה.
- להכנת תמיסת מלאי של 20 מ"מ (10,000x) של SB431542, יש להוסיף 10 מ"ג אבקה ל-1.3 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO). כדי להכין תמיסת מלאי של 2 mM (1,000x) של DMH1 (4-[6-(4-Isopropoxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline, 4-[6-[4-(1-Methylethoxy)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]-quinoline), להוסיף 10 מ"ג אבקה לתוך 13.1 מ"ל של DMSO. סנון, עיקור, aliquot, ולאחסן כל פתרון ב -20 ° C. יש להשתמש בכל אחד מהם בריכוז עבודה של 2 מיקרומטר במדיה (NM + SB431542 + DMH1).
הערה: פרוטוקול זה ממליץ על ריכוזי עבודה של 2 מיקרומטר הן של SB431542 והן של DMH1 בהתבסס על התצפיות שלנו ודיווחים של אחרים הקובעים כי ריכוז זה מקדם ביעילות אינדוקציה עצבית מתאי גזע גזעיים גזעיים. כמו כן דווח על ריכוזים גבוהים יותר. בנוסף, עם מדיה חלופית, הוכח גם כי מולקולות קטנות אינן נחוצות להמרה עצבית גבוהה. לפיכך, ריכוזי העבודה ישתנו בהתאם לסביבות תרבית תאים חלופיות, וריכוזים אופטימליים צריכים להיבדק על ידי חוקרים בודדים.
- כדי להכין תמיסת מלאי של דוקסיציקלין הידרוכלוריד (Dox), יש להמיס תחילה אבקה ב-DMSO ל-100 מ"ג/מ"ל ולאחסן בטמפרטורה של -20°C. לדלל אותו עוד יותר כדי ליצור תמיסת מלאי של 2 מ"ג / מ"ל (1,000x) ב- PBS ולאחסן ב -20 ° C. השתמש בריכוז עבודה של 2 מיקרוגרם / מ"ל במדיה; לדוגמה, הוסף 50 μL Dox ל- 50 מ"ל של NM (NM + Dox).
הערה: אין להקפיא מחדש את התמיסות לאחר ההפשרה.
2. יצירת תת-סוגים עצביים מתאים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hPSCs)
הערה: כל תרביות התאים צריכות להישמר באינקובטור עם 5% CO2 ב 37 ° C. תרביות אלה נשמרות ברמות חמצן בחדר, אם כי ניתן להשתמש ברמות נמוכות יותר.
- ליצור ולתחזק אבות אסטרוציטים (hAstros) מ hPSCs.
הערה: סעיף זה מספק פרוטוקול בידול קצר ופשוט. (איור 1A, קופסה ירוקה מנוקדת).
- אשכולות זרעים של hPSCs (איור 1B) על צלחות 6 בארות מצופות ECM עם 2 מ"ל של hPSC בינוני + Y לכל באר. יש להאכיל את תאי הגזע מדי יום עד שהם מתלכדים בכ-50% ומתפצלים לפי הצורך.
- כדי לפצל hPSCs, הוסף 1 מ"ל של מגיב עובר לבארות ולשאוף לאחר 1 דקה. לדגור על תאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, להוסיף 1 מ"ל של hPSC בינוני, ולפצל אגרגטים 1:10 על בארות מצופות ECM חדשות ב 2 מ"ל של hPSC בינוני + Y לכל באר.
- שמור על תאי הגזע עד שהם כ 50% confluent, ולאחר מכן לשנות מדיה NM + SB431542 + DMH1 כדי לגרום התמיינות עצבית (יום 0). כאשר התאים נפגשים בכ-95%, יש לפצל ביחס של 1:6 לבארות חדשות מצופות ECM באותו תווך.
- ביום ה -14, נתקו את התאים עם תמיסת ניתוק והעבירו לבקבוק לא מצופה עם Y כדי לקדם היווצרות אגרגטים.
הערה: התוספת של Y משמשת לקידום הישרדות התא ויצירת כדורים, אך אינה נכללת במהלך כל הזנה.
- עבור הדור של אבות עצביים ונוירונים (hNeurons), להשתמש אלה יום 14 תאים כדי להתמיין כפי שמתואר עבור תאים טרנסגניים.
- צור ותחזק נוירונים מושרים (iNeurons) מתאי גזע גזעיים (hPSC).
- זרע hPSCs טרנסגניים (עם נוירוגנין 2 יציב המושרה דוקסיציקלין) על לוחות 6 בארות מצופים ECM עם 2 מ"ל של hPSC בינוני + Y לכל באר (כמתואר לעיל עבור קווים שאינם טרנסגניים). יש להאכיל כל יום ב-2 מ"ל של מדיה לכל באר עד שהם מוכנים להרים ב-70% התמזגות. פיצול תאים כמתואר לעיל.
- כאשר התאים נפגשים בכ-35%, הוסיפו NM + Dox כדי לגרום להתמיינות ל-iNeurons.
הערה: תאים יעברו לאבות עצביים, אך עדיין לא יאריכו את תאי העצב.
