יצירת תחומי תרבות משותפת תלת-ממדית של אסטרוציטים ונוירונים כדי לגרום להיווצרות סינפסות

תקציר

מקור: Cvetkovic, C., et al. מידול מיקרו-מעגלים סינפטיים עם תרביות תלת-ממדיות של אסטרוציטים ונוירונים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים הליך לתרבית משותפת של אסטרוציטים ותאי עצב ליצירת כדורים תלת-ממדיים. ספירות תלת-ממדיות אלה מספקות פלטפורמה מובחנת לבחינת היווצרות סינפסות ואינטגרציה של רשתות עצביות, ובכך משמשות מודל פוטנציאלי למחקר במדעי המוח ההתפתחותיים, מחלות נוירודגנרטיביות והתערבויות נוירו-פרמקולוגיות.

פרוטוקול

1. הכנה ותחזוקה של קו-תרבויות תלת-ממדיות

1. נתק את hAstros מאגרגטים תלת-ממדיים בהשעיה.​
   1. נתקו בעדינות את אגרגטי האסטרוציטים האנושיים (hAstro) עם תמיסת ניתוק כאשר מופיעים מרכזים כהים והוציאו כדורים המתחברים באופן ספונטני. שברו כדורים בעדינות פעם בשבוע כדי לשמור על בריאות הכדור ולהימנע מליבות נמקיות.
      הערה: אין לחרוג מ-5 דקות טיפול בתמיסת ניתוק.
2. נתקו hNeurons או iNeurons מחד-שכבה דו-ממדית.
   1. הסר מדיה מהצלחת בעלת 6 הקידוחים והוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק לכל תרבית חד-שכבתית המכילה היטב של hNeuron (נוירון אנושי) או iNeurons (נוירונים מושרה). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. הוסף בעדינות 2-3 מ"ל DMEM/F12 מדיום בסיסי כדי להסיר תאים מחוברים.
   2. אספו תאים ומדיה בצינור חרוטי של 15 מ"ל ובצנטריפוגה במהירות של 300 x גרם למשך דקה אחת. שאפו את הסופרנטנט, הוסיפו 1 מ"ל של מדיה טרייה, ופיפטה מעלה ומטה בעדינות עם מיקרופיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי להשיג תרחיף חד-תאי.
3. יוצרים כדורים תלת-ממדיים באמצעות לוחות תרבית מיקרווול.
   1. הכינו את הצלחת על ידי הוספת 0.5 מ"ל של תמיסת שטיפה נגד היצמדות לכל באר של צלחת microwell. צלחת צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 5 דקות. לשאוף תמיסת שטיפה, להוסיף 1 מ"ל של מדיום בסיסי DMEM/F12 לכל באר כדי לשטוף, ולשאוף שוב.
      הערה: יש לוודא תמיד שהצנטריפוגה מאוזנת במהלך השימוש.
   2. ספור כל סוג תא באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. הוסף את היחס הרצוי של hAstros מנותקים ו- hNeurons או iNeurons לכל באר בנפח כולל של 2 מ"ל של תווך עצבי (NM) + Y (כלול Dox אם iNeurons מנוצלים). צלחת צנטריפוגה ב 100 x גרם במשך 3 דקות ולחזור לאינקובטור.
      הערה: לוחות מיקרו-באר של 24 בארות (ראה טבלת חומרים) מכילים 300 מיקרו-בארות לכל באר. הוסף מינימום של 6 x 10⁵ תאים (עבור כדורים של 2 x 10³ תאים כל אחד) ומקסימום של 6 x 10⁶ תאים (עבור כדורים של 2 x 10⁴ תאים כל אחד) ב 2 מ"ל של מדיה לכל באר. עבור כדורים בני קיימא בעלי צפיפות מסוימת בטווח זה, השתמש בכמות מוגדרת של תאים וחלק ב- 300 כדי לחשב את מספר התאים לכדור. ניתן להשתמש גם בשיטות וכלים חלופיים ליצירת כדור במידת הצורך. בצע את הוראות היצרן לקבלת טווחים מקובלים של צפיפות תאים.
   3. אפשרו לתאים להתאסף בעצמם לכדורים צפופים בתוך צלחות מיקרו-באר במהלך היומיים הבאים (איור 1A). החלף 50% מהמדיה אם התרבות מצהיבה.
      הערה: החליפו רק חצי מדיה ופיפטה בעדינות בעת הסרה והוספה של מדיה כדי לא להפריע לכדורים. כדורים עשויים להתרומם ממיקרו-בארות ולהתמזג יחד עם כוח גבוה יותר.
   4. לאחר יומיים, הסירו בעדינות כדורים ממיקרו-בארות בעזרת מיקרופיפטה של 1,000 מיקרו-ליטר (איור 2D). יש להפעיל בעדינות כוח על תחתית המיקרו-בארות בעזרת מדיה כדי להסיר כדורים נוספים שהודבקו. תנו לכדורים להתיישב בצינור חרוטי של 15 מ"ל, שאפו את המדיה הישנה והוסיפו מדיה רעננה.
4. הגדר את מערכת הביוריאקטור של בקבוק הספינר ליצירת כדורים תלת-ממדיים.​
   1. נקו את פני השטח של צלחת ערבוב מגנטית עם 70% אתנול, והכניסו אותה לאינקובטור תרביות תאים. Autoclave צלוחיות ספינר בודדות כדי לעקר.
   2. הוסיפו כדורים עם מדיה מינימלית של 50–60 מ"ל לכל בקבוק ספינר (איור 2D, כניסה). הניחו את הבקבוק על צלחת הערבוב המגנטית ב-60 סל"ד. כדורי תרבות בצלוחיות ספינר עד שהם מוכנים לאיסוף נתונים.
      הערה: מינימום של 3 שבועות בתרבית נדרש להיווצרות סינפסה.

תוצאות

איור 1: יצירה שיטתית וניתנת לשחזור של ספירות עצביות תלת-ממדיות מהונדסות-ביולוגית. (A) לוחות תרבית מיקרווול (μ-well) משמשים ליצירת ספירות עצביות תלת-ממדיות בעלות צפיפות רצויה ויחסי נוירון-אסטרוציטים באופן שיטתי ומוגדר על-ידי המשתמש, המניב גודל וצורה עקביים. התמונות מוצגות יום אחד לאחר היווצרות הכדור. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) טווח של צפיפויות תאים התחלתיות (מ-4...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
6 צלחת באר	פישר סיינטיפיק	08-772-1B
15 מ"ל צינורות חרוטיים	אולימפוס פלסטיק	28-101
אקוטאזה	סיגמא	A6964-100ML	פתרון ניתוק
צלחת AggreWell	טכנולוגיות תאי גזע	34850
תמיסת שטיפה נגד היצמדות	טכנולוגיות תאי גזע	7010	מניעת הידבקות תאים לצלחות מיקרו-באר
אנטי/אנטי	תרמופישר	15240062
B27	תרמופישר	17504044	מוסף מדיה
BrainPhys מדיום עצבי	טכנולוגיות תאי גזע	5790	חלופה נוירופיזיולוגית בינונית בסיסית
DMEM/F12	תרמופישר	10565-042	עם תוסף GlutaMAX
DMH-1	טכנולוגיות תאי גזע	73634	סכנה: רעיל בבליעה. ריכוז עבודה: 2 uM
נסיוב חמורים	מעבדות ביולוגיות Lampire	7332100	ריכוז עבודה: 5% במאגר חסימה ראשוני, 1% במאגר חסימה משני
דוקסיציקלין הידרוכלוריד (Dox)	סיגמא	D3072-1 מ"ל	סכנה: רעיל לנשים בהריון. ריכוז עבודה: 2 ug / mL
גורם גדילה אפידרמיס (EGF)	פפרוטק	AF-100-15	ריכוז עבודה: 10 ng/mL
גורם גדילה פיברובלסט-2 (FGF)	פפרוטק	100-18 ב'	ריכוז עבודה: 10 ng/mL
Hemacytometer או מונה תאים אוטומטי	לייף טכנולוגיות	AMQAX1000
מטריצת קרום מטריג'ל	קורנינג	354230	פתרון ציפוי ECM. ריכוז עבודה: 80 מ"ג / מ"ל. הכינו על קרח וודאו שהפיפטה, הצינורות והמדיה מקוררים מראש.
מערכת MEA 2100	מערכות רב ערוציות	MEA2100
מעכב רו-קינאז Y27632- (Y)	טוקריס	1254	ריכוז עבודה: 10 uM
SB431542	טכנולוגיות תאי גזע	72234	ריכוז עבודה: 2 uM
צלוחיות ספינר	פישר סיינטיפיק	4500-125
בקבוק תרבות T25	אולימפוס פלסטיק	25-207	מכסים מאווררים
כחול טריפאן	Invitrogen	T10282