כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנת תרביות MSC של חולדות
- קציר MSCs מן עצם הירך
- יש לבצע אוטוקלאבינג לכל כלי הדיסקציה (כלומר, מספריים לניתוח עדין, מספריים לחיתוך קהה ומלקחיים עם שיניים) בטמפרטורה של 180°C למשך שעתיים לפחות לפני השימוש.
- הכן מדיום גידול MSC המורכב ממדיום חיוני מינימלי - שינוי אלפא (αMEM) בתוספת 15% נסיוב בקר עוברי (FBS) ופניצילין/סטרפטומיצין (P/S, 1% v/v).
- להקריב חולדות Sprague Dawley זכר צעיר (200-250 גרם משקל גוף) על ידי מנת יתר של פנטוברביטון (240 מ"ג / ק"ג משקל גוף, intraperitoneal).
הערה: דגימות מח מחולדות שונות צריכות להיות מעובדות בנפרד.
- הניחו את בעלי החיים שהוקרבו במצב שכיבה. נקו היטב את הבטן והגפיים התחתונות עם 70% אתנול.
- הסר את העור ואת הרקמה התת עורית מעל הירכיים המדיאליות באמצעות מספריים ומלקחיים מנתחים עדינים. הסר את שרירי הירך עד לחשיפת עצם הירך. המשיכו בפעולה זו באופן קרוב ומרוחק עד למראה מפרקי הברך והירך. לפרק את עצם הירך דרך מפרק הירך והברך באמצעות מספריים חיתוך קהה.
הערה: אין לחצות את עצם הירך כדי לחשוף את חלל המח בשלב זה. מעבירים את עצם הירך השלמה למכסה המנוע של תרבית רקמת זרימה למינרית להמשך עיבוד.
- השתמש במספריים חיתוך קהות כדי להעביר את הקצוות הדיסטליים והפרוקסימליים של עצם הירך דרך המטפיזיזה.
- מניחים מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר מעל צינור חרוטי בנפח 50 מ"ל. יש להכניס מזרק בנפח 21 גרם, 10 מ"ל המכיל מלח חוצץ פוספט (PBS, 10 mM Na2HPO4, pH 7.4) לתעלת הירך החשופה ולשטוף את תכולת המח לתוך הצינור החרוטי על ידי שטיפה חוזרת.
הערה: כ-20 מ"ל של PBS משמש לשטיפת עצם הירך. אם צבע התוכן הסמוק נשאר מוכתם בדם ועכור, ניתן להשתמש בנפח גדול יותר.
- לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 480 x גרם במשך 5 דקות. להשליך את supernatant. להשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מ"ל של מדיום הגידול MSC. צלחת את התאים על צלחת תרבית רקמה 10 ס"מ. הכניסו את צלחות תרבית הרקמה לאינקובטור תאים (37°C, 5% CO2). רשום את היום הראשון של הציפוי כיום 0.
הערה: בכל השלבים הכרוכים בצנטריפוגה, יש לכוון את הבלם להאטה מרבית.
- הקמה והרחבה של מושבות MSC
הערה: פרוטוקול זה מסתמך על היצמדות פלסטית לתרבית רקמה כדי לבחור MSCs מתוך חלל המח. תוכן מח העצם מותר לדבוק פלסטיק תרבית רקמה במשך 2 ימים.
- ביום השני, שטפו את צלחות התרבית שלוש פעמים עם 10 מ"ל של PBS כדי להסיר תאים שאינם דבקים. החלף את PBS עם 10 מ"ל של מדיום גידול MSC לאחר שטיפה. לשטוף את התאים עם PBS ולחדש אותם עם MSC גידול בינוני כל 3 ימים.
הערה: מושבות MSC אמורות להיראות עד יום 6-7 (איור 1A).
- מעבר התאים עד יום 10 על ידי הסרת מדיום הגידול ושטיפת התאים עם PBS. הוסף 1.5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים אנזימטיים רקומביננטיים ודגור ב 37 ° C במשך 5 דקות. הוסף 3 מ"ל של מדיום גידול MSC כדי לנטרל את התגובה. לאסוף את התאים מנותקים על ידי צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות.
- כמת את התאים בתוך הגלולה באמצעות המוציטומטר לאחר דילול מתאים ב- PBS.
- זרעים העבירו תאים בצפיפות של 40,000 תאים לסמ"ק2 לתוך צלחת תרבית של 10 ס"מ במדיום גידול MSC.
הערה: חולדות MSCs אמורות להגיע למפגש של 80-90% תוך יומיים מרגע המעבר (איור 1B). ניתן להעביר תאים כמתואר בשלב 1.2.2 עבור עד 8 מעברים. ניתן לאפיין MSCs באמצעות אימונוציטוכימיה ויכולתם להתמיין בין טריל-שושלות (איור 2). רק תרביות MSC בין מעברים 3 ו-8 כפופות להתניה מוקדמת היפוקסית ולהעשרת אבות עצביים. MSCs בעלי מספר מעבר גדול יותר מאמצים מורפולוגיה שטוחה (איור 1C) ואינם מייצרים מספיק אבות עצביים. תרבויות אלה יש להשליך.
2. הכנת תרביות BMSC אנושיות
- לדלל 1 מ"ל של מח עצם אנושי לשאוף עם 9 מ"ל של מדיום גידול MSC צלחת את התאים על צלחת תרבית רקמה 10 ס"מ. לשמור על התרביות באינקובטור תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
- הסר את המדיום לאחר יומיים ושטוף בעדינות את התרביות שלוש פעמים עם 10 מ"ל של PBS כדי להסיר תאים שאינם דבקים. לאחר השטיפה הסופית, הסר את PBS והחלף אותו עם 10 מ"ל של מדיום גידול MSC. לחדש את מדיום הגידול לאחר כל 3 ימים של תרבית לאחר PBS לשטוף.
הערה: מושבות MSC צריכות להיות גלויות עד יום 6-7. מספר המושבות עשוי להשתנות בין נושאים.
- מעבר התאים ביום 10, כמתואר בשלב 1.2.2. כמת את התאים בתוך הגלולה באמצעות המוציטומטר לאחר דילול מתאים ב- PBS. זרעו את התאים העוברים בצפיפות של 40,000 תאים לסמ"ק2 על צלחת תרבית של 10 ס"מ במדיום גידול MSC.
הערה: MSCs אנושיים (איור 1D) מדגימים מורפולוגיה דומה ל-MSCs של חולדות, ואמורים להגיע למפגש של 80-90% תוך יומיים מרגע המעבר. הם צריכים להיות מאופיינים באמצעות immunocytochemistry ואת יכולתם התמיינות trilineage. בדומה לחולדות MSC, MSCs אנושיים בין מעברים 3 ו-8 כפופים להתניה מוקדמת היפוקסית ולהעשרת אבות עצביים.
3. התניה מוקדמת היפוקסית
- יש לפרק את רכיבי תא ההיפוקסיה (כלומר, בסיס, מכסה, מגשים) לאחר שחרור מהדק הטבעת ולנקות את החלקים הבודדים עם 70% אתנול. הניחו את רכיבי התא בתוך מכסה מנוע של תרבית רקמת זרימה למינרית לצורך עיקור תחת אור UV למשך 15 דקות.
- לפני התניה מוקדמת היפוקסית, להסיר את המדיום ולשטוף את החולדה ואת תרביות MSC אנושי (סעיפים 1 ו -2) עם 10 מ"ל של PBS. החלף את PBS עם 10 מ"ל של מדיום צמיחה MSC בתוספת 25 mM HEPES.
הערה: MSCs תרבית על כלים 10 ס"מ צריך להגיע 80-90% מפגש לפני להיות כפוף preconditionic preconditionic.
- הניחו את מנות התרבות בתוך תא ההיפוקסיה. הרכיבו מחדש את רכיבי התא והדקו את מהדק הטבעת. שטפו לתוך התא תערובת גז של 99% N2/1% O2 בקצב זרימה של 10 ליטר/דקה למשך 5 דקות.
- אטמו את הקצוות המחברים של תא ההיפוקסיה כדי להבטיח שאין דליפת גז. הניחו את התא בתוך אינקובטור התא (37°C, 5% CO2) למשך 16 שעות.
- עם השלמת ההתניה המוקדמת ההיפוקסית, הסר את התרביות מהחדר כהכנה לתרבות העשרת האב העצבי שלאחר מכן.
4. תרבות העשרת אבות עצביים
- הכינו תווך אב עצבי המורכב מתערובת התזונה F12 (DMEM/F12) של Dulbecco בתוספת B27 (2% v/v), גורם גדילה פיברובלסטי בסיסי (bFGF, 20 ננוגרם/מ"ל), גורם גדילה אפידרמלי (EGF, 20 ננוגרם/מ"ל) ו-P/S (1% v/v).
- נתק את החולדה/MSCs ההיפוקסיים המותנים מראש, כמתואר בשלב 1.2.2. לאסוף את התאים מנותקים על ידי צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות. לכמת את התאים בתוך הגלולה באמצעות המוציטומטר לאחר דילול מתאים ב- PBS.
- להשהות מחדש את התאים בתווך אב עצבי וזרעים על צלחות בעלות חיבור נמוך, 6 בארות בצפיפות של 6,000 תאים לסמ"ק2. מניחים את התרבית באינקובטור תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך 12 יום. לחדש 75% של מדיום אב עצבי כל 3 ימים.
הערה: צבירי תאים גדולים שאינם דבקים יש לראות בימים 6-7. ביום 10-12 ניתן להבחין בנוירוספרות בקוטר ≥ 100 מיקרומטר (איור 3). MSCs היפוקסיים מותנים מראש אמורים להניב יותר נוירוספרות מאשר MSCs בתרבית בתנאים נורמוקסיים.
- לאסוף נוירוספרות ביום 12 על ידי שאיפה אותם לתוך פיפטה 10 מ"ל ולהעביר אותם צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה את הנוירוספרות ב 250 x גרם במשך 5 דקות.
הערה: נוירוספרות יכולות להיות מאופיינות ביום ה -12 עבור סמני אב עצביים, כגון nestin ו- GFAP.
5. יצירת תאים דמויי תאי Schwann
- הכינו מדיום השראת גליה המורכב מ-αMEM בתוספת β-Heregulin (100 ננוגרם/מ"ל), bFGF (10 נ"ג/מ"ל), גורם גדילה הנגזר מטסיות דם (PDGF-AA, 5 ננוגרם/מ"ל), FBS (10%) ו-P/S (1% v/v).
- לוחים את הנוירוספרות שהוכנו בסעיף 4 בלוחות 6 בארות מצופות PDL/למינין בצפיפות של 5-10 כדורים לס"מ2 ב-1.5 מ"ל של מדיום אינדוקציה גליה לכל באר. החלף את מדיום השראת הגליה כל יומיים לאחר שטיפת התאים עם PBS.
הערה: תאים מנוירוספרות זרעים נראים נודדים החוצה ביום השני. ביום השביעי, לתאים נודדים יש מראה מחודד והם אמורים להפגין אימונופוזיטיביות עבור סמני תאי Schwann p75 קולטן נוירוטרופין (p75) ו-S100β. תאים אלה מכונים SCLCs.
