יצירת תאי שוואן מחויבים לגורל באמצעות תרבות משותפת עם נוירוני DRG
1. הכנת נוירונים DRG של חולדה מטוהרת
- בצע Autoclave את כל כלי הדיסקציה (כלומר, מספריים לנתיחה, מלקחיים, שני מלקחיים microdissection, ומספריים microdissecting) ב 180 ° C לפחות 2 שעות לפני השימוש.
- צפו צלחות תרבית רקמה בנות 6 בארות בפולי-D-ליזין (PDL, 10 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS) ב-4°C למשך הלילה. יש להסיר את ה-PDL ולשטוף ב-PBS באורך 1.5 מ' לכל באר.
- המשך עם ציפוי הצלחות עם למינין (10 מיקרוגרם / מ"ל ב PBS) ב 37 ° C במשך 2 שעות. לשטוף את הצלחות עם 1.5 מ"ל של PBS לכל באר.
- הכינו מדיום תחזוקת נוירונים DRG, המורכב ממדיום נוירובזאלי בתוספת B27 (2% v/v), L-גלוטמין (1% v/v), גורם גדילה עצבי (NGF, 20 ננוגרם/מ"ל) ופניצילין/סטרפטומיצין (P/S, 1% v/v).
- הכינו מדיום טיהור נוירונים DRG, המורכב ממדיום נוירובזאלי בתוספת B27 (2% v/v), L-גלוטמין (1%), גורם גדילה עצבי (NGF, 20 ננוגרם/מ"ל), p/s (1%), פלואורודאוקסיורידין (FDU, 10 מיקרוגרם/מ"ל) ואורידין (10 מיקרוגרם/מ"ל).
- להקריב חולדות בהריון ביום ההריון 14-15 על ידי מנת יתר pentobarbital (240 מ"ג / ק"ג משקל גוף, intraperitoneal).
- הניחו את בעלי החיים שהוקרבו במצב שכיבה. נקו את הבטן ביסודיות עם 70% אתנול.
- חותכים את דופן הבטן התחתונה של החיה לאורכה באמצעות מספריים ומלקחיים מנתחים עדינים. לזהות ולהסיר את הרחם באמצעות מספריים דיסקציה. חתכו את דופן הרחם כדי לחשוף ולחלץ את העוברים. מעבירים את העוברים לצלחת תרבית סטרילית בקוטר 10 ס"מ מלאה ב-PBS. מניחים את צלחת התרבות על קרח.
- מעבירים את העובר המיועד לדיסקציה לצלחת תרבית סטרילית בקוטר 10 ס"מ מלאה ב-PBS (טמפרטורת החדר) ומניחים אותו מתחת למיקרוסקופ דיסקציה. יש את העובר במצב נוטה.
הערה: ניתן לראות את חוט השדרה הלבנבן ואת ה- DRG המחובר על פני האספקט הגבי של העובר, דרך עורו השקוף.
- הכנס מלקחיים זעירים לאורך שני צדי חוט השדרה והשתמש בדיסקציה קהה כדי להתחיל להפריד את חוט השדרה מהרקמה הרכה שמסביב. חתכו את חוט השדרה ללא קשר לבעל החיים באמצעות מלקחיים זעירים לאורך פתח הצוואר וגבעולי הזנב. בצע דיסקציה קהה נוספת מעל האספקט הגחוני של החוט כדי לשחרר אותו מהרקמה הרכה שמסביב.
- השתמש במלקחיים microdissecting כדי להסיר רקמה רכה שיורית מעל האספקט הגבי של חוט השדרה המשוחרר.
הערה: בשלב זה אמורים להישאר רק חוט השדרה, שורשי העצבים וה-DRG המחוברים.
- נתקו DRG בודדים משורשי העצבים המחברים שלהם באמצעות מלקחיים מיקרו-דיסקרטיים. השתמש בעט פיפטה המחובר לקצה של 1 מ"ל כדי להעביר את ה- DRG לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מ"ל המכיל PBS.
הערה: עבור כל צינור של 1.5 מ"ל, ניתן להכיל מקסימום של 100 DRGs.
- צנטריפוגה את DRGs ב 250 x g במשך 5 דקות ו resuspend אותם ב ריאגנט דיסוציאציה תאים אנזימטיים רקומביננטי (200 μL לכל צינור). יש לדגור (37°C, 5% CO2) למשך 10 דקות. צנטריפוגו את ה-DRGs ב-250 x גרם למשך 5 דקות, הסירו את הסופר-נטנט והשהו מחדש במדיום תחזוקת נוירוני DRG. נתקו את הגלולה על ידי טריטורציה עדינה באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. כמת את התאים בתוך הגלולה באמצעות המוציטומטר לאחר דילול מתאים.
- זרעו את התאים בצפיפות של 5,000 תאים/ס"מ2 לתוך לוחות PDL/למינין מצופים 6 בארות ב-1.5 מ"ל של מצע תחזוקת נוירונים DRG לכל באר. לאחר יומיים של תרבית, הסר את מדיום תחזוקת נוירוני DRG, שטוף עם PBS, והחלף במדיום טיהור נוירונים DRG.
הערה: עבור כל מחזור טיהור, לטפל בתרביות DRG עם מדיום טיהור במשך יומיים, ולאחר מכן יום אחד של דגירה במדיום תחזוקה. לאחר 3-4 מחזורי טיהור, צפויה הסרת כל גליה אנדוגנית. זה אמור לקחת בערך 14 ימים. תרביות מטוהרות נמצאו חיוביות לסמן העצבי TUJ1 ונעדרות עבור ביטוי S100β (איור 1).
2. יצירת תאים דמויי תאי Schwann
- הכינו מדיום השראת גליה המורכב מ-αMEM (Minimum essential medium Eagle (MEM), שינויי אלפא) בתוספת β-Heregulin (100 ננוגרם/מ"ל), גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, 10 נ"ג/מ"ל), גורם גדילה הנגזר מטסיות דם (PDGF-AA, 5 ננוגרם/מ"ל), נסיוב בקר עוברי (FBS, 10%) ו-P/S (1% v/v).
- לוחית את הנוירוספרות שהוכנו בסעיף 4 בלוחות 6 בארות מצופות PDL/למינין בצפיפות של 5-10 כדורים לסמ"ר ב-1.5 מ"ל של תווך אינדוקציה גליה לכל באר. יש להחליף את מדיום השראת הגליה כל יומיים לאחר שטיפת התאים ב-PBS.
- הערה: תאים מנוירוספרות זרעים נראים נודדים החוצה ביום השני. ביום השביעי, לתאים נודדים יש מראה מחודד והם אמורים להפגין אימונופוזיטיביות עבור סמני תאי Schwann p75 קולטן נוירוטרופין (p75) ו-S100β7. תאים אלה מכונים SCLCs.
3. תרבות משותפת של SCLCs עם נוירונים DRG
- הכן מדיום קוקולטורה המורכב ממדיום תחזוקת נוירונים DRG (שלב 1.1.4) ומדיום אינדוקציה גליה (שלב 1.2.1) ביחס נפח-נפח של 1:1.
- הכינו מדיום תחזוקת תאי Schwann המורכב מתערובת F-12 (DMEM/F12)) של Dulbecco בתוספת FBS (5%), β-Heregulin (10 ng/mL) ו-P/S (1% v/v).
- הסר את מדיום התרבית מיום 7 SCLCs, שטוף אותם עם PBS, ודגר אותם עם 0.5 מ"ל / באר של מגיב דיסוציאציה תאים אנזימטי רקומביננטי ב 37 ° C למשך 5 דקות. להשעות מחדש את SCLCs במדיום coculture.
- כמת את התאים באמצעות hemocytometer לאחר דילול מתאים.
- זרעו את ה-SCLCs על תרביות נוירוני DRG מטוהרים בצפיפות של 1,000 תאים לסמ"ק2. לשמור על cocultures במשך 14 ימים, עם החלפה בינונית כל 2 ימים.
הערה: במהלך התרבות המשותפת, SCLCs רכשו את המורפולוגיה דמוית הציר האופיינית לתאי Schwann בוגרים (איור 2). תאים אלה מתמידים בפנוטיפ שלהם לאחר נסיגה של גורמי גדילה והם מסוגלים myelinate אקסונים במבחנה in vivo. החיוביות של סמני תאי Schwann (כלומר, p75 ו- S100β) צריכה להיות מנוטרת על ידי immunofluorescence.
- עם השלמת ההתרבות המשותפת, עוברים תאי שוואן המחויבים לגורל. השתמש 0.5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה לכל באר. כמת את התאים באמצעות hemocytometer לאחר דילול מתאים.
<...