$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. פיתוח מיקרו-עמודות הידרוג'ל אגרוז
- הכינו תמיסת אגרוז במשקל 3% משקל/נפח (w/v) על ידי שקילת 3 גרם אגרוז והעברתה לכוס סטרילית המכילה 100 מ"ל של מלח חוצץ פוספט של דולבקו (DPBS). מוסיפים פס מגנטי סטרילי לכד, ומניחים אותו על משטח פלטה/מערבב חם. שמור את הכוס מכוסה כדי למנוע אידוי של התוכן שלה בשלב הבא.
- מחממים את האגרוז וה-DPBS בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס ומערבבים ב-60-120 סל"ד. התאם הגדרות אלה לפי הצורך, ועקוב כל הזמן אחר התקדמות תהליך הפירוק כאשר התמיסה משתנה בתחילה ממראה אטום למראה ברור המסמן כי האגרוז התמוסס לחלוטין.
זהירות: הכד החם והפתרון חמים!
- כאשר תמיסת האגרוז מחוממת ומעורבבת, שלפו ארבע צלחות פטרי ריקות בקוטר 10 ס"מ והוסיפו 20 מ"ל של DPBS לשתיים מהן. הניחו מחטי דיקור (קוטר: 300 מיקרומטר, אורך: 40 מ"מ), צינורות נימי מיקרוליטר זכוכית (קוטר: 701.04 מיקרומטר, אורך: 65 מ"מ, קיבולת: 25.0 μL), ומתקן נורה בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. כאשר תמיסת האגרוז הנוזלית מתנקה, יש לשמור על חימום קבוע בטמפרטורה של כ-50 מעלות צלזיוס ולערבב כדי למנוע ג'לציה של האגרוז.
- הכניסו מחט דיקור לתוך הפתח התחתון של מתקן נורות. הכנס צינור נימי מעל המחט החשופה מבחוץ. אבטח את צינור הנימים על ידי הזנת חלק ממנו לחלק הגומי של גליל מתקן הנורה.
- מעבירים 1 מ"ל של אגרוז נוזלי עם מיקרופיפטה לפני השטח של צלחת פטרי ריקה, ומניחים קצה אחד של צינור הנימים אנכית (עם המחט מוכנסת) במגע עם אגרוז, בעוד מכסה הגומי של מתקן הנורה נצבט פנימה. שחררו באיטיות את הלחץ על מכסה מתקן הנורה כדי למשוך אגרוז לתוך צינור הנימים.
הערה: העברת אגרוז נוזלי לתוך צינורות נימים חייב להתבצע במהירות. אם האגרוז הנוזלי נשאר להתקרר על משטח צלחת הפטרי למשך זמן מספיק (כ -60 שניות), הוא מתחיל לג'ל, ומונע שאיבה מתאימה של האגרוז לאורך צינור הנימים.
- מניחים כל מכלול נורה-צינור-מחט בצלחת פטרי חופשית, ומניחים לג'ל האגרוז בתוך צינורות הנימים להתמצק למשך 5 דקות. משכו בזהירות את צינור הנימים עם הידיים החוצה מפקק הגומי בגליל מתקן הנורה, ומשאירים את המחט ואת ג'ל האגרוז במקומם בתוך הצינור.
- חלץ ידנית את מחט הדיקור על ידי שליפתה באיטיות מתוך צינור הנימים; גליל האגרוז שהתמצק לאחרונה מחליק גם הוא מתוך הצינור בהליך זה, עדיין מקיף את המחט. דחפו בעדינות את עמוד המיקרו לאורך מחט הדיקור עם קצה המלקחיים הסטריליים כדי להזיז אותו לקצה. הניחו את המחט מעל צלחת פטרי פתוחה המכילה DPBS ודחפו את המיקרו-עמוד לתוך ה-DPBS בעזרת מלקחיים.
הערה: אם מיקרו-עמוד האגרוז נשאר בתוך צינור נימי הזכוכית עם הסרת מחט הדיקור, דחפו לאט את מיקרו-עמוד האגרוז החוצה מצינור הנימים עם מחט מד 25 מ"מ לתוך הצלחת עם DPBS.
- יש לעקר מיקרו-אזמלים או מלקחיים באמצעות מעקר חרוזים חם. הפוך 4% w / v agarose על ידי שקילת 4 גרם של agarose ולהעביר אותו 100 מ"ל של DPBS. חממו וערבבו כמוסבר בשלב 1.2 לקבלת תמיסת אגרוז נוזלית שקופה 4%. הקפידו על חימום וערבוב של התמיסה לאורך השלבים הבאים.
- מעבירים את צלחות הפטרי המכילות את עמודי המיקרו למכסה מנוע, ומעבירים מיקרו-עמוד עם מלקחיים עדינים לצלחת פטרי ריקה. השתמש בסטריאוסקופ להנחיה חזותית ובמיקרו-אזמל כדי לחתוך את המיקרו-עמודות לאורך הרצוי. חתוך את שני הקצוות ליצירת קצוות משופעים בזוויות של 45מעלות מאופקיות כדי להקל על הטיפול במיקרו-עמודות במהלך מטריצה חוץ-תאית (ECM) וחיבור תאים.
- חזרו על השלב הקודם עבור שלושה מיקרו-עמודים נוספים באותה צלחת פטרי ויישרו את ארבעת המבנים במקביל להפרדה של <3 מ"מ בין כל אחד מהגלילים. העמיסו 50 מיקרוליטר של תמיסת אגרוז 4% עם מיקרופיפטה ושפכו פס/קו נוזל על מערך המיקרו-טורים כדי לחבר ולאגד את המבנים לקבוצות של ארבעה (להלן "סירות מיקרו-עמודות"). הימנעו מתנועה של 4% אגרוז לקצות המיקרו-עמודות, שעלולות לסתום את החלק הפנימי, על ידי מזעור המרחק בין המבנים והוספת האגרוז במהירות בקו דק.
הערה: סידור קבוצות של ארבעה מיקרו-עמודים ל"סירות" אינו נדרש כדי לייצר את הפיגומים האסטרוציטים. עם זאת, הסירות משמשות כדי לזרז את תהליך הייצור ולהציע דרך בטוחה יותר לנוע ולטפל במיקרו-עמודות בשלבים מאוחרים יותר.
- תנו לסירת המיקרו-עמוד להתקרר במשך 1-2 דקות כדי לאפשר ג'לציה של תוספת של 4% אגרוז. הרימו את סירת המיקרו-טור עם מלקחיים עדינים על ידי חיבור 4% אגרוז, והעבירו את המיקרו-עמודות לצלחת הפטרי האחרת המכילה DPBS שהוכנה בשלב 1.1.3. ייצרו סירות נוספות עם שאר עמודי המיקרו לפי הצורך.
- העבירו את צלחות הפטרי המכילות את עמודי המיקרו ו/או הסירות לארון בטיחות ביולוגית ועיקרו בחשיפה לאור אולטרה סגול (UV) למשך 30 דקות.
זהירות: יש ללבוש הגנה מתאימה למניעת חשיפה לקרינת UV.
- אחסנו את הכלים עם סירות המיקרו-עמודה ב-DPBS בטמפרטורה של 4°C, אם חיבור ECM וציפוי תאים לא יתרחשו מיד לאחר מכן, עד שבוע אחד. חזור על שלבי ייצור המיקרו-עמודות אם לא נעשה שימוש במבנים במהלך פרק זמן זה.
2. תרבית תאים ראשונית ובידוד
- בידוד אסטרוציטים קורטיקליים מגורי חולדות
- כהכנה לשלבים הבאים, הוסיפו 20 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) לארבע צלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ שישמשו כמאגרים לרקמות המנותחות. שומרים את כל הכלים על קרח. יש לעקר מספריים כירורגיים נקיים, מלקחיים, מיקרו-מרית ומיקרו-אזמלים במעקר חרוזים חם.
- טרום חם 0.25% טריפסין עם 1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ו 0.15 מ"ג / מ"ל deoxyribonuclease (DNase) I ב HBSS ב 37 ° C. בנוסף, חממו מראש את מדיום תרבית האסטרוציטים ב -37 מעלות צלזיוס, המורכב ממדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם תערובת התזונה F-12 של Ham וסרום בקר עוברי 10% (FBS).
- הרדימו את גורי החולדות לאחר הלידה ביום 0 או ביום 1 על ידי חשיפתם למצבים היפותרמיים והרדמתם על ידי עריפת ראש. הצמד את הראש לשלב באמצעות מחט מד 19 מ"מ הממוקמת בחוטם הקדמי לעיניים.
- בצע חתך עם אזמל במורד החלק האחורי האמצעי לקדמי, מבסיס הצוואר עד ממש מאחורי העיניים. בצע חתך נוסף הולך לרוחב ישירות מאחורי העיניים כלפי מטה, ויוצר צורת T. השתמש במלקחיים עדינים כדי למשוך את עור הגולגולת / גולגולת הצידה.
- החזיקו את הראש על ידי החוטם (עם הפנים כלפי מעלה) על ידי הנחת שן אחת של המלקחיים בפיו של בעל החיים והשנייה על המשטח החיצוני. מוציאים את המוח עם מיקרו-מרית סטרילית ומניחים אותו באחת מצלחות הפטרי המלאות ב-HBSS צונן. הניחו את צלחת הפטרי על קרח מיד לאחר מכן ובכל עת, למעט בעת השימוש.
- מקם גוש גרניט שאוחסן בעבר ב -20 ° C מתחת לסטריאוסקופ בתוך מכסה מנוע. הניחו את צלחת הפטרי עם רקמת המוח על פני גוש הגרניט כדי לשמור על הטמפרטורה הנמוכה שלה במהלך הליך הנתיחה. השתמש בסטריאוסקופ כהנחיה חזותית לאורך השלבים הבאים.
- אם נורות הריח נשארות שלמות, חלצו אותן על ידי חיתוך עם מלקחיים או מיקרואזמלים. בנוסף, השתמש במיקרואזמל כדי להסיר את המוח הקטן ולבצע חתך בקו האמצע המפריד בין שתי ההמיספרות המוחיות. מעבירים את ההמיספרות בעזרת מלקחיים לצלחת פטרי המכילה HBSS טרי וצונן.
- לנתח את מבני המוח התיכון מתוך ההמיספרות עם מיקרואזמל כדי להשיג רק את קליפת המוח המופרדת. השתמשו במלקחיים עדינים כדי לקלף את קרומי המוח, מבנה דמוי יריעה, מרקמת קליפת המוח ולהעביר את קליפת המוח המבודדת לצלחת פטרי חדשה עם HBSS קר. השתמש במיקרואזמל כדי לטחון את הרקמה על מנת להגדיל את שטח הפנים לפעולת טריפסין בשלב הבא.
- השתמש פיפטה פסטר כדי להעביר את קליפת המוח לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל של טריפסין-EDTA שחומם מראש (8 קליפות בכל צינור). חשוף את רקמת קליפת המוח טריפסין-EDTA במשך 5-7 דקות ב 37 ° C.
- עם פיפטה פסטר, בזהירות להסיר את טריפסין-EDTA ולהוסיף 400 μl של 0.15 מ"ג / מ"ל DNAse I פתרון לצינור צנטריפוגה. יש להסעיר את הצינור או המערבולת עד שכל הרקמה מנותקת ולא נותרות חתיכות רקמה בנוזל. אם לא ניתן להמיס לחלוטין את הרקמה, להסיר את השברים הנותרים עם קצה פיפטה פסטר.
- צנטריפוגה את הצינור המכיל את תמיסת התא המנותק ב 200 x גרם למשך 3 דקות. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטת פסטר מבלי להפריע לתאים. הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית אסטרוציטים (מוגדר בשלב 2.1.2) לצינור עם מיקרופיפטה ותסיס כדי להשהות מחדש וליצור תמיסה הומוגנית.
- העברת 10 מ"ל של מדיום תרבית אסטרוציטים עם פיפטה סרולוגית לצלוחית T-75. הוסף 250 μl של תמיסת תאים 1 מ"ל (שהוכנה בשלב 2.1.11) עם מיקרופיפטה לבקבוק כדי צלחת מוח אחד של תאים לכל צלופית. פזרו את תמיסת התאים המשוחררים באופן שווה על פני מדיום התרבית ועוררו בעדינות את הבקבוק כדי לקדם פיזור אחיד.
- תרבית את הצלוחיות המצופות באינקובטור לח ב 37 ° C ו 5% CO2. לאחר שהגיע 24 ו 72 שעות בתרבית, מכנית לעורר את הבקבוק לנתק סוגי תאים שאינם דבקים, כגון נוירונים ואוליגודנדרוציטים.
- לאחר מכן, בכל אחת מנקודות הזמן הללו, בצע שינוי מדיה. החזיקו את הבקבוק במאונך כך שמצע התרבית מונח בתחתית הצלוחית, ולא מכסה את התאים המודבקים. שואפים את מדיום התרבית עם פיפטה פסטר, לחיצה על קצה פיפטה על הפינה התחתונה של הבקבוק כדי למנוע חילוץ התאים. מניחים את הבקבוק במצב האופקי המקורי ומוסיפים בעדינות 10 מ"ל של מדיום אסטרוציטים מעל התאים עם פיפטה סרולוגית.
- החזירו את הצלוחיות לחממה לאחר כל החלפת מדיה. לאחר שהושגה התמזגות של 90%, יש לסעיר את הבקבוק באופן מכני פעם נוספת כדי להסיר את התאים הנותרים שאינם נצמדים.
- מעבירים את האסטרוציטים על ידי הוצאת מדיום התרבית עם ואקום ופיפטה של פסטר. הוסף 5 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA עם פיפטה סרולוגית מעל התאים המודבקים. יש להסעיר בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח שהטריפסין מכסה את כל התאים, ולדגור על הבקבוק במשך 5-7 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- להרוות טריפסין על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום אסטרוציטים לתאים עם פיפטה סרולוגית. חלצו את תמיסת התא מהבקבוק עם פיפטה סרולוגית והעבירו אותה לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל. צנטריפוגה את הצינור ב 200 x גרם במשך 3 דקות.
- הסר את supernatant עם פיפטה סרולוגית ו resuspend אותו ב 1 מ"ל של מדיום תרבית אסטרוציטים. תססו את הצינור כדי להבטיח שתמיסת התא הומוגנית. ספור את מספר התאים בתמיסה באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
הערה: בקבוק שהוא 90% קונפלואנטי מניב בדרך כלל כ-3 מיליון אסטרוציטים.
- הוסף 10 מ"ל של מדיום תרבית אסטרוציטים לצלוחית T-75. בצע דילול 1:4 על ידי העברת 250 μl של תמיסת התא (שלב 2.1.18) עם מיקרופיפטה לבקבוק T-75 שכבר מכיל מדיום תרבית. יש להתסיס בעדינות כדי להבטיח פיזור תאים הומוגני על פני השטח של הצלוחית.
- חזור על שלבים 2.1.16-2.1.19 בכל פעם שמושג מפגש של 90% כדי לעבור את התאים.
- בידוד נוירונים קורטיקליים מעוברי חולדות
- בצע הכנות דומות כמו שלבים 2.1.1 ו 2.1.2, למעט כי התקשורת מראש מחומם הוא מדיה co-culture, המורכב מדיום נוירובזאלי + 2% B-27 תוספת (עבור נוירונים) + 1% G-5 ללא תוספת סרום (עבור אסטרוציטים) + 0.25% L-גלוטמין.
- המתת חסד ביום עוברי מתוזמן בהריון 18 חולדות Sprague-Dawley עם חנק פחמן דו חמצני ולאשר מוות על ידי עריפת ראש.
- חלצו את עוברי החולדה ונתחו את קליפת המוח משאר רקמת המוח בצלחות פטרי המכילות HBSS על פני גוש הגרניט המצונן, באמצעות סטריאוסקופ להנחיה חזותית ומספריים מעוקרים, מיקרו-אזמל ומלקחיים. לאחר הנתיחה הרצופה של הראשים, המוחות, ההמיספרות המוחיות וקליפת המוח, העבירו כל רקמה לצלחת פטרי חדשה מלאה ב-HBSS.
- טחנו את רקמת קליפת המוח למקטעים קטנים יותר כדי להגדיל את שטח הפנים של טריפסין. מעבירים 4-6 קליפות עם פיפטת פסטר לצינור עם 5 מ"ל של טריפסין-EDTA שחומם מראש ושומרים על טמפרטורה של 37°C כדי לנתק את הרקמה. ב 5-7 דקות ידנית להסעיר את הצינור כדי לערבב ולמנוע גושים של הרקמה.
- הסר את הצינור מ 37 ° C לאחר 10 דקות. כפי שהוסבר קודם לכן בשלב 2.1, חלצו את טריפסין-EDTA והחליפו אותו ב-1.8 מ"ל של תמיסת DNAse במינון 0.15 מ"ג/מ"ל. לאחר מכן, מערבלים את הרקמה עד שהתמיסה נראית הומוגנית, ללא שברי רקמה צפים בנוזל.
- צנטריפוגה את תמיסת הרקמה המנותקת ב 200 x גרם במשך 3 דקות. לאחר הסרת supernatant, resuspend ב 2 מ"ל של מדיום תרבות משותפת. ספור את מספר התאים בתמיסה זו באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
הערה: התשואה הרגילה היא 3.0-5.0 x 106 תאים / חצי כדור קליפת המוח.
- הכינו תמיסת תאים חדשה בצפיפות של 2.0-4.0 x 105 תאים/מ"ל במדיית התרבית המשותפת שהוגדרה לעיל.
3. התפתחות הכבלים האסטרוציטיים בתוך המיקרו-עמודות
- ייצור ליבת ECM
הערה: יש להוסיף את ה-ECM לחלק הפנימי של מיקרו-עמודות ההידרוג'ל באותו יום שבו תבוצע זריעת תאים.
- בתוך ארון בטיחות ביולוגית, הכינו תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל של קולגן מסוג I זנב חולדה בתרבית משותפת בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי. שמור על צינור המיקרוצנטריפוגה עם תמיסת ECM על קרח בכל עת, למעט בעת השימוש.
- העבר 1-2 μL של תמיסת ECM עם מיקרופיפטה על רצועה של נייר לקמוס כדי להעריך את ה- pH שלה. הוסף 1 μL של 1 N נתרן הידרוקסידי (NaOH) או חומצה הידרוכלורית (HCl) עם מיקרופיפטה כדי להגדיל או להקטין את ה- pH של תמיסת ECM, בהתאמה, פיפטה למעלה ולמטה הומוגניזציה. אמת את ה- pH החדש עם רצועת נייר לקמוס והוסף עוד חומצה או בסיס, לפי הצורך, עד שה- pH יציב בטווח 7.2-7.4.
- העבירו את צלחות הפטרי משלב 1.2 לקולט אדים, והעבירו 4-5 מיקרו-עמודים או סירה עם מלקחיים עדינים סטריליים לצלחת פטרי ריקה וסטרילית בקוטר 35 או 60 מ"מ. באמצעות הסטריאוסקופ להנחיה, מקם את קצה 10 μL של מיקרופיפטה בקצה אחד של כל מיקרו-עמודה ויניקה כדי לרוקן את לומן של DPBS ובועות אוויר. אשר את היעדר בועות האוויר באמצעות הסטריאוסקופ כדי להבטיח שה- ECM שנוסף בשלב הבא יוכל לזרום בחופשיות על פני הלומן.
- טען מיקרופיפטה P10 עם תמיסת ECM, מקם את קצה 10 μL בקצה אחד של עמודות מיקרו הידרוג'ל, ולספק פתרון מספיק כדי למלא את לומן (כ 3-5 μL), התבוננות בכניסה של ECM עם הסטריאוסקופ. פיפטה מאגר קטן (2-4 μL) של תמיסת ECM משני קצותיה של המיקרו-עמודה.
הערה: יש לנהל תמיד 4-5 מיקרו-עמודים או סירה אחת בכל פעם כדי למנוע ייבוש ממושך של המבנים, מכיוון שהדבר עלול לגרום להתמוטטות מבנה המיקרו-עמודות. מיקרו-עמודים מיובשים לחלוטין נצמדים היטב לפני השטח של צלחות הפטרי, מה שמונע את ניצולם לזריעת תאים. לא ניתן להוסיף כמויות מוגזמות של מדיה לתרבית משותפת (כאמצעי הידרציה) למיקרו-עמודות מכיוון שהדבר עלול לגרום ל-ECM לזרום החוצה במהלך תקופת הדגירה המתוארת להלן.
- פיפטה תרבית מדיה בטבעת סביב צלחת פטרי כדי לספק כיור לחות כדי למנוע את העמודים להתייבש במהלך הדגירה. דגרו על צלחת הפטרי המכילה מיקרו-עמודות המכילות ECM בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך שעה אחת כדי לקדם פילמור של קולגן לפני הוספת הנוירונים ו/או האסטרוציטים.
הערה: ה- ECM צריך ליצור שכבה המצפה את פני השטח הפנימיים של לומן החלול, ולא ליבת ECM מוצקה המקיפה את הפנים, אשר ניתן לצפות בשניהם באמצעות הסטריאוסקופ. אם ECM יוצר ליבה, המשך את תקופת הדגירה עד שתישאר רק השכבה. עם יצירת שכבה זו, תמיסת תאי האסטרוציטים יכולה למלא את פנים המיקרו-עמוד בשלבי הציפוי.
- במהלך תקופת הדגירה, הכינו את תמיסת תאי האסטרוציטים (כמתואר להלן).
- זריעת אסטרוציטים ותאי עצב במיקרו-עמודות
- מעבר האסטרוציטים המצופים (בין המעבר הרביעי לשנים עשר) כמוסבר בשלבים 2.1.16-2.1.19. לאחר ספירת מספר התאים בצלוחית, הכינו את תמיסת התאים בצפיפות של 9.0-12.0 x 105 תאים/מ"ל תמיסת תמיסת תרבית תאים.
- באמצעות סטריאוסקופ, מקם את קצה מיקרופיפטה P10 בקצה אחד של עמודות המיקרו, והעבר תמיסת תא מספקת (~ 5 μL) לתוך לומן כדי למלא אותו לחלוטין. כפי שנעשה לעיל עם ECM, הוסף מאגרים קטנים של תמיסת תאים לשני הקצוות של כל מיקרו-עמודה.
- דגרו על המיקרו-עמודים המצופים על צלחות הפטרי בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך שעה אחת כדי לקדם את החיבור של אסטרוציטים ל-ECM. אם תאי עצב לא יתווספו למיקרו-עמודות, המשך לשלב 3.2.5.
- לאחר תקופת הדגירה הראשונית, הוסף 1-2 μL של תמיסת נוירון קליפת המוח המתקבלת בשלב 2.2.7 לשני הקצוות של עמודות המיקרו עם מיקרופיפטה, תוך התבוננות מתחת לסטריאוסקופ. ודא כי מספיק מדיה נוכחת בכלים כדי למנוע ייבוש, ודגרה שוב במשך 40 דקות ב 37 ° C ו 5% CO2 כדי לאפשר הידבקות של נוירונים.
הערה: ניתן להוסיף תמיסת נוירון קורטיקלית גם 1-2 ימים לאחר היווצרות צרור, ביצוע שלב 3.2.4 לאחר הסרה זהירה של אמצעי התרבית מצלחת הפטרי עם מיקרופיפטה.
- לאחר תקופת הדגירה, מלאו בזהירות את צלחות הפטרי המכילות את עמודי המיקרו המצופים ב -3 או 6 מ"ל של מדיה לתרבית משותפת עבור צלחות פטרי 35 או 60 מ"מ, בהתאמה. שמור על מיקרו-עמודות מצופות בתרבית ב 37 ° C ו 5% CO2 כדי לקדם את ההרכבה העצמית של צרורות אסטרוציטים מיושרים, אשר אמור ליצור מבנה צרור דמוי כבל לאחר 6-10 שעות.