פיתוח מודל תלת-ממדי מבוסס משי מבוסס קולגן של רקמה עצבית מקוטבת

Abstract

מקור: Chwalek, K. et al., מודל מבוסס משי מהונדס מבוסס קולגן של רקמה עצבית מקוטבת.J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מציג את יצירתו של מודל רקמה עצבית מקוטבת תלת-ממדית באמצעות פיגומים משי-קולגן. הוא מפרט את תהליך זריעת התאים העצביים על פיגומי משי נקבוביים, דגירה לחיבור תאים, הטבעה של הפיגום בקולגן, ומדגיש את חשיבותה של מטריצת הקולגן התומכת ביצירת מודל רקמה עצבית מקוטבת תלת-ממדית.

Protocol

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנת פיגום משי

1. הכנת תמיסת משי מפקעות בומביקס מורי
   1. חותכים כל גולם ל 8 חתיכות שוות באמצעות מספריים. השתמש על 11 פקעות עבור 5 גרם של פקעות מקוטעות. (15 דקות)
   2. מכינים 2 ליטר של תמיסת 0.02 M Na₂CO₃ ומרתיחים בעזרת פלטה חשמלית. (15 דקות)
   3. שוקלים 5 גרם של פקעות מקוטעות ומרתיחים אותם בתמיסת Na₂CO₃ למשך 30 דקות. מערבבים את המשי הרותח כל כמה דקות עם מרית. שלב זה, הנקרא דה-גמינג, מטהר פיברואין משי מחלבונים הידרופיליים, סריצינים. (30 דקות)
   4. מוציאים את הפיברואין ביד ושוטפים אותו במים מזוקקים לפחות שלוש פעמים כדי לשטוף את שאריות הסריצין והכימיקלים. (5 דקות)
   5. מניחים את הפיברואין הרטוב על צלחת פטרי ומייבשים את תמצית הפיברואין במכסה המנוע O/N.
   6. למחרת, שוקלים את מסת הפיברואין היבשה ומניחים את הפיברואין בכד זכוכית. (15 דקות)
   7. כדי להמיס את הפיברואין בתמיסת LiBr 9.3 M, חשב את הנפח הנדרש (במ"ל) של LiBr על ידי הכפלת המסה של פיברואין יבש ב -4. שפכו באיטיות תמיסת LiBr על פיברואין המשי והשתמשו במרית כדי לטבול את כל סיבי הפיברואין. כסו את הכד למניעת אידוי והניחו אותו על 60°C למשך 4 שעות כדי לאפשר לסיבים להתמוסס. (15 דקות)
   8. בעזרת המזרק, אספו את תמיסת הפיברואין מהכוס והעמיסו אותה לקלטות הדיאליזה MWCO 3,500. יש לבצע דיאליזה כנגד מים מזוקקים למשך 48 שעות. החליפו את המים כל כמה שעות.
   9. באמצעות המזרק, לאסוף את תמיסת פיברואין מן הקלטות לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל צנטריפוגה פעמיים ב 9,000 סל"ד (~ 12,700 x גרם) ב 4 ° C במשך 20 דקות. לאחר כל שלב צנטריפוגה, יוצקים את הסופרנאטנט לתוך צינור טרי ומשליכים את הכדור. (40 דקות)
   10. למדוד את ריכוז הפיברואין על ידי הערכת המשקל היבש. יוצקים 1 מ"ל של תמיסת משי לתוך סירת שקילה. יבש את הדגימה בתנור ב 60 ° C במשך 2 שעות. לשקול את פיברואין משי יבש ולחשב את הריכוז של פתרון פיברואין משי על ידי הכפלת המשקל המתקבל על ידי 100. הריכוז הצפוי של תמיסת משי הוא 6-9% (w/v).
   11. התאימו את ריכוז המשי ל-6% (w/v) על ידי דילול במים מזוקקים.
       נקודת עצירה: ניתן לאחסן את פיברואין המשי הנוזלי בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש במיכל סגור.
2. הכנת פיגומים נקבוביים מתמיסת משי.
   1. מסננת את NaCl הגרגירי כדי להפריד את הגרגירים 500-600 מיקרומטר, אשר ישמשו בשלבים מאוחרים יותר. יש להשליך את הגרגירים בגודל נמוך מ-500 מיקרומטר ומעל 600 מיקרומטר. (15 דקות)
   2. שפכו 30 מ"ל של תמיסת משי 6% לתוך תבנית פוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE) (איור 1). מפזרים בעדינות 60 גרם של NaCl מנופה על המשי. הקש על המיכל כדי לקבל שכבת מלח אחידה. דגרו 48 שעות ב-RT כדי לפלמר את המשי.
   3. הכניסו את תבנית ה-PTFE המכילה פיגומים לתנור בטמפרטורה של 60°C למשך שעה אחת כדי לסיים את תהליך הפילמור ולאדות את כל הנוזלים שנותרו.
   4. מניחים את תכולת תבנית ה-PTFE בכוס המכילה 2 ליטר מים מזוקקים למשך 48 שעות כדי להוציא את המלח. החליפו את המים 2-3 פעמים ביום. מוציאים את פיגומי הספוג מהתבניות כאשר המלח נפלט לחלוטין החוצה.
      נקודת עצירה: ניתן לאחסן את הספוגים במים בטמפרטורה של 4°C במיכל סגור כדי למנוע התייבשות של הפיגומים.
   5. חותכים את הפיגומים עם ניקוב ביופסיה בקוטר 5 מ"מ כאשר הם מוכנים. חתכו מראש את הפיגומים כך שיגיעו לגובה של כ-2 מ"מ. ניקבו את מרכז הפיגום בעזרת ניקוב ביופסיה בקוטר 2 מ"מ (איור 2A). (1 שעות)
   6. Autoclave פיגומים שקועים במים כדי לעקר אותם (מחזור רטוב, 121 ° C, 20 דקות).
      נקודת עצירה: ניתן לאחסן את הספוגים במים בטמפרטורה של 4°C במיכל סגור כדי למנוע התייבשות של הפיגומים.
   7. לפני זריעת התאים המתוכננת, יש לטבול את הפיגומים בתמיסת פולי-D-ליזין סטרילית (PDL) במינון 0.1 מ"ג/מ"ל. יש לדגור במשך שעה אחת ב-37°C.
   8. שטפו את הפיגומים פי 3 במי מלח חוצצי פוספט (PBS) כדי להסיר PDL שאינו קשור. (30 דקות)

2. בידוד של תאי עצב בקליפת המוח של חולדה

1. יש לנתח קליפות מוח מיום עוברי 18 (E18) של חולדות Sprague-Dawley לאחר קבלת פרוטוקול בעלי החיים המאושר. (2 שעות)
2. לדגור על 10 קליפות ב-5 מ"ל של 0.25% טריפסין עם 0.3% DNase I (מלבלב בקר) למשך 20 דקות ב-37°C.
3. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת 1 מ"ג/מ"ל של חלבון סויה.
4. שלשו את קליפת המוח באמצעות פיפטה של פסטר בנפח 10 מ"ל על ידי פיטינג למעלה ולמטה 20 פעמים עד ליצירת תרחיף של תא בודד. היו עדינים והימנעו מהיווצרות בועות אוויר. (10 דקות)
5. צנטריפוגה את מתלה התא ב 127 x גרם במשך 5 דקות.
6. יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-10 מ"ל של מדיום תרבית (מדיום נוירובזאלי, 1x תוסף B27, 1x גלוטמקס, 1% פניצילין/סטרפטומיצין). ספור את התאים. ריכוז התאים הצפוי הוא כ 2x10⁷/ml. (20 דקות)

3. בניית הרכבה ותרבות

1. זריעת פיגומים עם תאים
   1. הזיזו את הפיגומים הסטריליים ואת כל הכלים הדרושים בתוך מכסה מנוע של תרבית תאים. מניחים את הפיגומים בצלחת תרבית תאים בת 96 בארות באמצעות מלקחיים סטריליים, ומקצים פיגום אחד לכל באר. (10 דקות)
   2. טבלו את הפיגומים בתווך תרבית התאים כדי לאזן אותם לפני זריעת התא. יש לדגור במשך שעה אחת ב-37°C (10 דקות)
   3. שאפו את עודף התווך מהפיגומים.
   4. יש למרוח 100 מיקרוליטר של תרחיף/פיגום תאים. (10 דקות)
   5. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37°C O/N כדי לאפשר חיבור תאים לפיגומים.
   6. למחרת בבוקר, שאפו את התאים שאינם מחוברים ומרחו 200 מיקרוליטר/באר של מדיום תרבית טרי. (10 דקות)
2. הטבעה של פיגומים עם מטריצת קולגן. (2 שעות)
   1. מניחים 10x PBS, מים, 1 N NaOH וזנב חולדה I קולגן על קרח. הכינו תמיסת עבודה של קולגן לפי הוראות היצרן. יש לשמור על קרח עד שמבני זרעי התאים מוכנים (עד שעה).
   2. מוציאים את מבני המשי מזרע התא מהאינקובטור ושואבים את התווך העודף.
   3. מעבירים את הפיגומים לבארות הריקות על צלחת הבאר באמצעות מלקחיים סטריליים וטובלים כל פיגום בתמיסת קולגן 3 מ"ג/מ"ל. החזירו את צלחת תרבית הרקמה לאינקובטור למשך 30 דקות כדי לאפשר פילמור קולגן.
   4. יש למרוח 100 μl של תרבית תאים שחוממה מראש בינונית/טובה. תרבות המבנים במשך שבוע אחד, שינוי המדיום כל יום על ידי החלפת רק מחצית נפח של המדיום.

Results

איור 1. תבנית PTFE המשמשת להכנת פיגום ספוג משי. המידות: קוטר 10 ס"מ, גובה 2 ס"מ.

איור 2. 3D מודל רקמה דמוי מוח. (A) פיגום ספוג משי נקבובי. (B) צביעה חיה/מתה של תאי עצב ביום הראשון בעת הזריעה על פיגום משי לפני הטבעה של קולגן (תאים ירוק...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צנטריפוגה 5804 R	אפנדורף
פולי-D-ליזין	סיגמא-אולדריץ'	P6407-5MG	ריכוז סופי 10 מק"ג/מ"ל, מומס במים
מדיום נוירובזאלי	גיבקו	21103049	יש להתחמם עד 37°C לפני השימוש
תוסף B27 פי 50	גיבקו	17504-044
גלוטמקס	גיבקו	35050-061
פניצילין סטרפטומיצין	קורנינג	30-002-CI
קולגן I, זנב חולדה, 100 מ"ג	קורנינג	354236	ריכוז סופי 3 מ"ג/מ"ל
נאוה	סיגמא-אולדריץ'	S2770	קורוזיבי
PBS	סיגמא-אולדריץ'	D1283-500ML
Na2CO3	סיגמא-אולדריץ'	223530
LiBr	סיגמא-אולדריץ'	213225
קלטות דיאליזה MWCO 3500	תרמו פישר	66110
פלטת חימום	פישר סיינטיפיק	איזוטמפ
נפה	פישר סיינטיפיק	מס' 270, מס' 35, מס' 30
PTFE			עובש תוצרת בית (איור 1) קוטר 10 ס"מ, גובה 2 ס"מ
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	71382
ביופסיה פונץ' 5 מ"מ	מכשיר מדויק עולמי	501909
ביופסיה פונץ' 2 מ"מ	מכשיר מדויק עולמי	501908
טריפסין	סיגמא-אולדריץ'	T4049-500ML
דנאז	רוש	10104159001	ריכוז סופי 0.3%
חלבון סויה	סיגמא-אולדריץ'	T6522-100MG	ריכוז סופי 1 מ"ג/מ"ל