$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. תקופת בידול לפני ציפוי מחדש
- להבדיל נוירונים על צלחות 10 ס"מ, באמצעות פרוטוקול של בחירה, עד נוירונים יצרו רשת עבה עם התהליכים שלהם לבטא לא רק סמנים עצביים מוקדמים כגון MAP2 או TuJ1, אלא גם סמנים מאוחרים כגון NeuN.
- שנה מחצית ממדיום הבחירה כל 4 ימים במהלך תהליך ההתמיינות העצבית.
הערה: שינויים בינוניים נרחבים יותר או תכופים יותר מדללים גורמים טרופיים חיונייםaq ועלולים לפגוע בהבשלה.
- עבור תאי עצב WT126 שמקורם ב-iPSC, השתמש באמצעי ההתרבות הבאים שלאחר ההתמיינות: 5 מ"ל 100x תוסף N2 (עצבי), 10 ננוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF), 10 ננוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי נגזר מקו תאי גליה (GDNF), 1 מיקרוגרם / מ"ל למינין, 200 מיקרומטר חומצה אסקורבית, 1 מיקרומטר dibutyryl-cAMP ו 10 מ"ל SM1 עבור 500 מ"ל תערובת בינונית / תזונתית של Dulbecco F-12 (DMEM/F12). בהדרגה, באמצעות שינויים חצי מדיה, להחליף עם מדיום בסיסי עצבי (טבלה של חומרים) ואת אותם תוספים.
- עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים או נוירוני CVB WT שמקורם ב- iPSC, השתמש במדיום התרבית הבא לאחר ההתמיינות: 500 מ"ל מדיום בסיסי עצבי A (רשימת חומרים) ו- 500 מ"ל DMEM/F12 בינוני עם 2 מיקרוגרם/מ"ל למינין, 10 מ"ל תוסף גלוטמין (טבלה של חומרים), 0.75 מ"ג/מ"ל סודיום ביקרבונט, 5 מ"ל חומצות אמינו לא חיוניות בינוניות חיוניות (MEM) מינימליות, 0.2 mM חומצה אסקורבית, 10 ng/mL BDNF, 20 מ"ל 50x B27, ו 10 מ"ל 100x N2 תוסף.
2. ציפוי מולטיוולים
- יום לפני ציפוי מחדש, מעיל עם poly-L-ornithine (אש"ף). ממיסים אש"ף במים סטריליים ליצירת תמיסת ציר (10 מ"ג/מ"ל). יש לאחסן מלאי זה בטמפרטורה של -20°C. לדלל את אש"ף 1:100 במים כדי להפיק ריכוז של 50 מיקרוגרם/מ"ל בעת ציפוי זכוכית ויחס של 1:1,000 (10 מיקרוגרם/מ"ל) בעת ציפוי פלסטיק.
- מרחו את הציפוי ישירות על לוחות היעד. השתמש בנפח הציפוי המתאים לגודל הצלחת (כלומר, עבור צלחת של 24 בארות יש למרוח 500 מיקרוליטר של תמיסת PLO לכל באר).
- אפשרו לצלחות לשבת בחושך למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
- יש לאחזר צלחות מצופות ביום הציפוי מחדש ולהעביר לארון בטיחות ביולוגית סטרילי.
- יש לשאוף את תמיסת אש"ף ולשטוף פעמיים במים סטריליים.
- למינין מדולל (1.15 מ"ג/מ"ל) במי מלח חוצצי פוספט (PBS) בדילול של 1:400.
הערה: הפשירו למינין בטמפרטורה של 4°C והוסיפו במהירות ל-PBS כדי למנוע הצטברות של למינין וציפוי לא אחיד.
- לשאוף מים סטריליים ולמרוח 500 μL של ציפוי למינין על בארות שצופו בעבר באש"ף.
- מניחים את הצלחות באינקובטור של 37°C למשך 4-6 שעות לפחות. יש להשתמש באינקובטורים ארוכים יותר, עד 16 שעות, עבור משטחי זכוכית. השתמש בזמני דגירה עקביים.
3. ציפוי מחדש של תאי עצב מובחנים
- שטפו את הצלחת של תאי עצב ממוינים עם PBS פעם אחת בעדינות. פזרו PBS בעדינות במורד דופן הצלחת, ולא ישירות על התאים, כדי למנוע הפרעה להם.
- שאפו בעדינות PBS, נזהרו להימנע מלגעת ישירות בתאים אלא לשאוף מקצה הצלחת תוך הטייתה, לכיוון החוקר.
- יש למרוח לפחות 1 מ"ל של האנזים הפרוטאוליטי (טבלת חומרים) לכל צלחת של 10 ס"מ ולהחזיר את התאים לאינקובטור. הוסיפו נפחים מעט גבוהים יותר אם חדר תרביות הרקמה מציג קצב אידוי גבוה עקב לחות נמוכה.
- לדגור על תאים עם אנזים פרוטאוליטי במשך 40-45 דקות כדי לנתק אותם מהצלחת ולנתק אותם מתאי עצב אחרים ברשת העצבית.
הערה: העיתוי בשלב זה הוא קריטי. מרווה מוקדמת מדי של הפרוטאז עלולה להוביל למוות מוגבר של תאים לאחר ציפוי מחדש. יצרן האנזים המפרקי חלבון ממליץ להשתמש בטמפרטורות נמוכות בהרבה מ-37°C עם תקופות דגירה ארוכות יותר עבור שורות תאים עוברות (למשל, לילה ב-4°C). עם זאת, יש להימנע מטיפול בנוירונים ב -4 מעלות צלזיוס, מכיוון שלעתים קרובות הם מראים הישרדות גרועה לאחר חשיפה לקור. היצרן גם קובע כי דגירה של 60 דקות עם האנזים ב 37 מעלות צלזיוס מוביל להשבתה אנזימטית שלה. עם זאת, מניסיונם של המחברים, דגירה של 40-45 דקות של תרביות עצביות שמקורן ב-hiPSC ב-37 מעלות צלזיוס מספיקה לדיסוציאציה יעילה ולהישרדות עצבית מצוינת לאחר ציפוי מחדש.
- בדקו את תאי העצב במיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה בזמן הדגירה ואפשרו את המשך הטיפול בפרוטאז עד שהרשת העצבית תתנתק לחלוטין מהצלחת ותתחיל להתפרק ליריעות קטנות יותר לאחר ניעור קצר של הצלחת מתחת למיקרוסקופ.
- להרוות את פעילות הפרוטאז באמצעות 5 מ"ל של מדיה DMEM טרי לכל 1 מ"ל של פרוטאז בצלחת 10 ס"מ כדי לעצור את העיכול. בעדינות triturate תאים כנגד הצלחת 5-8 פעמים כדי לשבש את הרשת, באמצעות פיפטות סרולוגיות. היזהר לא להפעיל לחץ רב מדי בעת trituating, כמו נוירונים מובחנים הם שבירים. אין להשתמש בקצה P1000, מכיוון שהקצה חד וצר מדי, ולכן יכול לשקוף או לפגוע בנוירונים.
- יש למרוח תמיסה עם תאים דרך מסננת תאים עם רשת בקוטר 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי טרי של 50 מ"ל טיפה אחר טיפה.
- שטפו את המסננת עם 5 מ"ל נוספים של מדיית DMEM טרייה, לאחר שהתאים סוננו דרכם.
- סובב תאים בצנטריפוגה של ספסל במהירות של 1,000 x גרם למשך 5 דקות.
- החזירו את הצינור החרוטי לארון הבטיחות הביולוגית ושאפו את רוב המדיה, תוך השארת כ-250 μL כדי להבטיח שהתאים ישמרו על לחות.
- להשהות תאים בעדינות ב 2 מ"ל של מדיה DMEM טרי. אין להצמיד את הגלולה לצד הצינור. במקום זאת, הפוך בעדינות את הצינור החרוטי 2-3 פעמים והעבר תאים דרך קצה של צינור סרולוגי 5 מ"ל כדי לעקור אותם.
- החל 10 μL של נוירונים resuspended על קצה hemocytometer.
- הוסף 8-10 μL של כחול טריפאן לטיפת התאים כדי להעריך את כדאיות התא במהלך שלב ההשעיה הזה. החל 10 μL של תערובת זו על hemocytometer או מוני תאים אוטומטיים אחרים. להעריך כקיימא את התאים כי הם פאזה בהיר ולא לכלול את צבע כחול טריפאן.
- לקבוע את כמות התאים קיימא / מ"ל, ולהתכונן לדלל את התוכן של הצינור החרוטי בהתאם לצפיפות התא הרצויה.
- צלחת ~ 10,000 תאים לבאר עבור צלחת 384 באר; צלחת ~ 150,000-200,000 תאים לבאר עבור צלחת של 24 בארות.
- הוסף DMEM טרי לצינור החרוטי של תאים מרחפים כדי להשיג דילול מתאים והוסף תוספים מתאימים נוספים כגון B27 ו / או BDNF, בהתאם לדרישות של קו התאים הספציפי.
- הטו בעדינות את הצינור החרוטי כדי לערבב 2-3 פעמים.
- יש לשאוף ציפוי למינין מהצלחת בעלת 24 הבארות או מהצלחת הרב-בארית בעלת 384 הבארות באמצעות צינור בן 16 ערוצים ולשטוף פעם אחת עם PBS.
- שאפו PBS באמצעות P1000 עבור צלחת 24 בארות או פיפטה 16 ערוצים עבור לוחות 384 בארות.
- יש למרוח תמיסת תאים על כל באר בתנועה של הספרה שמונה כדי למנוע היווצרות גושים. אחידות הציפוי עשויה להיות ממוטבת גם באמצעות התקנים אוטומטיים לטיפול בנוזלים.
הערה: תוספת של למינין למדיה החל 2-4 ימים לאחר replating גם מסייע לשמור על פיזור הומוגני של התאים.
- חזור על שלבים 3.19 ו- 3.20 עבור כל באר.
- מחזירים את הצלחת לאינקובטור, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
- לאחר יומיים, התחל להחליף מחצית מהמדיום כל 4 ימים באמצעות מדיית הטיפוח שלאחר הדיפרנציאציה המתוארת בסעיף 1.2.