$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ייצור עובש SU-8 על ידי פוטוליתוגרפיה
הערה: הליך זה כרוך בכימיקלים מסוכנים. יש להשתמש במנדף וב-PPE לכל אורכו.
- נקו את פרוסת הסיליקון (קוטר 4 אינץ', עובי 1 מ"מ, מלוטשת) עם אצטון ונשפו בגז חנקן. לאחר מכן אופים ב 180 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות לייבוש.
- יש להוציא 3 מ"ל של SU-8 2100 על רקיק נקי.
- מצפים את ה-SU-8 באופן אחיד על הפרוסות באמצעות מעיל מסתובב ב-500 סל"ד למשך 10 שניות ולאחר מכן, מסתובבים ברצף ב-1500 סל"ד למשך 30 שניות עם תאוצה של 300 סל"ד לשנייה כדי לקבל שכבה בעובי 150 מיקרומטר של SU-8.
הערה: ודא שפרוסת הסיליקון ממוקמת במרכז ציפוי הסחיטה ומקובעת כראוי באמצעות ואקום.
- אופים ברכות, את הוופל על הצלחת החמה בטמפרטורה של 50°C למשך 10 דקות, ב-65°C למשך 7 דקות, וב-95°C למשך 45 דקות.
- כוונו את מסיכת הפוטו (איור 1) ליישור המסכה וחשפו אור UV (365 ננומטר) למשך 60 s.
הערה: זמן החשיפה צריך להיות אופטימלי על ידי מינון מתאים של אור UV.
- לאחר החשיפה, אופים את הוופל בטמפרטורה של 65°C במשך 6 דקות, וב-95°C במשך 13 דקות על הצלחת החשמלית.
- לפתח את רקיק במשך 10-20 דקות מפתח SU-8 עם תסיסה באמצעות שייקר מסלולי, שינוי הפתרון בפיתוח פעם אחת במהלך התהליך.
הערה: הארך את זמן הפיתוח כאשר הפסולת של SU-8 נשארת.
- שוטפים את הפרוסת באיזופרופנול ומייבשים בעדינות את הפרוסות בגז חנקן.
- מדוד את גובה SU-8 שהושקע על ידי מיקרוסקופ מדידה וודא שהוא בעובי של כ -150 מיקרומטר. ניתן לאחסן אותו ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר.
2. ייצור שבב תרבית רקמה מבוסס מיקרופלואידים פולידימתילסילוקסאן (PDMS)
- תקן את רקיק SU-8 שהופקד למיכל (למשל, צלחת פטרי פלסטיק 15 ס"מ) על ידי סרט דו-צדדי.
- פוצצו את האבק מהפרוסה באמצעות גז חנקן.
- כדי ליצור סילאניזציה, הניחו את רקיק SU-8 בתא ואקום יחד עם מיכל קטן (למשל, צלחת 35 מ"מ). זרוק 10 μL של (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane לתוך המיכל הקטן. אין למרוח ישירות את (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane על פרוסת SU-8.
- סגור את תא הוואקום בחוזקה והפעל משאבת ואקום למשך שעתיים לפחות.
- קחו פלסטיק ומזגו את אלסטומר הסיליקון (למשל, סילפוט 184 או שווה ערך, סילגארד 184) ואת חומר הריפוי ביחס משקל של 10:1. לאחר מכן, מערבבים היטב בעזרת מרית ודגאס בתא הוואקום עד להסרת הבועות לחלוטין.
- יוצקים את תערובת PDMS לתוך המיכל עם רקיק SU-8 לעובי הרצוי (3-4 מ"מ) ו degas שוב כדי להסיר בועות.
- אופים את PDMS בתנור ב 60 מעלות צלזיוס לפחות 3 שעות כדי לרפא לחלוטין את PDMS.
- לאחר הקירור, חתכו את ה-PDMS שנרפא מהפרוסה באמצעות אזמל או סכין גילוח.
- כדי ליצור את שני התאים של שבב תרבית הרקמה, נקב שני חורים שבהם ממוקמים שני התאים באמצעות ניקוב ביופסיה בקוטר 1.5 מ"מ.
- ליצירת מאגר בינוני, הכינו תערובת PDMS נוספת (אלסטומר סיליקון וחומר הריפוי ביחס משקל של 10:1) ומזגו אותה לצלחת פטרי חדשה בקוטר 10 ס"מ. כוונן את נפח המזיגה לעובי של 5 מ"מ של PDMS.
- אופים את PDMS בתנור ב 60 מעלות צלזיוס לפחות 3 שעות כדי לרפא לחלוטין את PDMS.
- לאחר קירור PDMS, לחתוך את PDMS נרפא עם אזמל כדי לקבל טבעת מלבנית.
- קשרו את השכבה התחתונה עם המאגר הבינוני על ידי מריחת PDMS שלא נרפא ביניהם ואפיית שכבות PDMS שהורכבו. מבנה מלוכד זה יוצר את שבב תרבית הרקמה PDMS.
- נקו את שבב תרבית הרקמה PDMS באמצעות סקוטש טייפ כדי להסיר אבק וחלקיקים קטנים מפני השטח. שבבי תרבית רקמת PDMS ניתנים לאחסון בטמפרטורת החדר אם הם מוגנים מפני אבק ו- UV.
3. הכנת תרבות
- תרבות בינונית
הערה: יש לסנן את כל המדיה המפורטת להלן לצורך עיקור, אלא אם צוין אחרת. ניתן לאחסן מדיה מוכנה בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש בה תוך חודש.
- להכנת mTeSR Plus בינוני: יש לשלב בקבוק אחד של תוסף mTeSR Plus 5x במינון 100 מ"ל עם בקבוק אחד של 400 מ"ל של mTeSR Plus Basal Medium.
- להכנת 100 מ"ל של מדיום KSR: ב-85 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו או DMEM/F12, יש להוסיף 15 מ"ל של תחליף סרום נוקאאוט (KSR, 15%), 1 מ"ל של תוסף גלוטמין מסחרי (1%) ו-1 מ"ל של חומצת אמינו לא חיונית (NEAA, 1%).
- כדי להכין 100 מ"ל של מדיום N2: ב 100 מ"ל של מדיום נוירובזאלי, להוסיף 1 מ"ל של N2 (100x), 1 מ"ל של תוסף גלוטמין מסחרי, ו 1 מ"ל של NEAA.
- כדי להכין 250 מ"ל של מדיום התבגרות: ב 250 מ"ל של מדיום נוירובזל, להוסיף 5 מ"ל של B27 (2%), 2.5 מ"ל של תוסף גלוטמין מסחרי (1%), ו 2.5 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין (1%).
- יש להשהות מחדש את התרכובות (חומצה רטינואית (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) ב-DMSO ברמת תרבית תאים לריכוז הרצוי. הכינו aliquots ולאחסן אותם ב -20 °C עד 6 חודשים. פתרונות המניות הבאים משמשים: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- ציפוי
הערה: כדי למנוע פילמור של מטריצת קרום המרתף על ידי חום, הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים. טפל בכל הליכי הציפוי עם קצוות פיפטה מקוררים מראש וצינורות במידת האפשר. יש להפשיר את מטריצת קרום המרתף למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בקצוות פיפטה וצינורות מקוררים מראש. aliquots ניתן להקפיא ב -20 ° C או -80 ° C.
- הפשירו את האליקוט הקפוא ב-4 מעלות צלזיוס על קרח. aliquot צריך להישמר קר במהלך הליך הציפוי. בעזרת קצה פיפטה מקורר מראש, דללו את מטריצת קרום המרתף עם DMEM/F12 קר כקרח ביחס של 1:40. מטריצת קרום מרתף מדוללת שאינה בשימוש יכולה להיות מאוחסנת ב -4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים, בהתחשב בכך שלא התרחש פילמור.
- הוסף 1 מ"ל של מטריצת קרום המרתף / תמיסת DMEM-F12 כדי לצפות באר אחת של צלחת 6 בארות.
- לדגור על הצלחת בטמפרטורת החדר לפחות שעה, או 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה. צלחות מצופות ניתן לאחסן ב 4 ° C לכל היותר של שבוע אחד.
4. תחזוקה של תאי iPS
- הכינו צלחות מצופות מטריצת קרום מרתף כפי שהוזכר קודם לכן בשלב 3.2.
- שאפו באופן מלא למדיום mTeSR Plus. לשטוף את הבאר פעם אחת עם PBS ולהוסיף 0.5 מ"ל של מגיב עובר (ראה טבלה של חומרים). חכו כמה שניות ושאפו לפתרון.
- דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37°C באינקובטור למשך 5 דקות או עד שהתאים הופכים עגולים.
הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בין קווי תאי iPS שונים לבין המפגש. יש לבדוק מעת לעת תחת המיקרוסקופ כדי לקבוע את זמן הדיסוציאציה במהלך הדגירה.
- הוסף 1 מ"ל של mTeSR Plus בינוני והקש על הצלחת במשך 30-60 שניות כדי לנתק את המושבות.
- ערבבו בעדינות 1 מ"ל של תמיסת תרחיף התא עם 7 מ"ל של mTeSR טרי בתוספת בינונית. אין פיפטה יותר מ 5 פעמים.
- צלחת ביחס של 1:8. בדרך כלל מוסיפים 1 מ"ל של המתלה משלב 5.5 ומוסיפים 1 מ"ל של mTeSR בתוספת מדיה בתוספת 5-10 מיקרומטר של Y-27632 (מעכב רוק). יחס דילול המעבר תלוי בקו iPSC.
- מקמו את התא באינקובטור של 5% CO2/37°C. למחרת, הסר Y-27632 על ידי הוספת מדיום mTeSR Plus טרי. לאחר מכן, החליפו מדיה כל יומיים בהתחלה, וכל יום כשהתא מגיע למפגש גבוה יותר.
5. התמיינות תאי iPS לנוירונים מוטוריים
- העברת iPSC עבור התמיינות נוירונים מוטוריים
הערה: ניתן לבצע בידול בהצלחה בפרוטוקול תלת מימד (5.2).
- אפשרו לתאי iPS לא ממוינים לגדול עד שהם מגיעים למפגש של כ-80% בתווך mTeSR Plus בצלחת בעלת 6 בארות.
- לגמרי לשאוף את המדיום. מיד לשטוף את הבאר פעם אחת עם PBS סטרילי ולהוסיף 0.5 מ"ל של פתרון דיסוציאציה התא לתאים.
- דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור למשך כ-2-3 דקות, או עד שהתאים הופכים מופרדים ועגולים אך נשארים מחוברים לבאר.
- הוסף 1 מ"ל של פיפטה בינונית ובעדינות למעלה ולמטה כמה פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל. העבר את השעיית התא לצינור 15 מ"ל המורכב מ -4 מ"ל של המדיום.
- צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 3 דקות.
- בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר את הגלולה ללא הפרעה, ו resuspend את התאים ב 1 מ"ל של המדיום בתוספת 10 מיקרומטר של Y-27632.
- ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר והמשיכו ל-5.2 (התמיינות תלת-ממדית).
- היווצרות ספרואיד נוירון מוטורי (MNS) בהתמיינות תלת-ממדית ("פרוטוקול תלת-ממדי")
הערה: שינוי בינוני מלא נעשה מדי יום מימים 0-12 של התמיינות (איור 2).
- זרעו את תאי iPS משלב 5.1.7 לצלחת U 96 באר ב 40,000 תאים / באר ב 100 μL של mTeSR Plus בתוספת 10 מיקרומטר של Y-27632.
- למחרת, להחליף כל באר עם 100 μL של המדיום טרי.
- בימים 0 ו-1: שאפו את מדיום התרבית והוחלפו ב-100 מיקרוליטר של מדיום KSR (3.1.2) בתוספת 10 מיקרומטר SB431542 ו-100 ננומטר LDN-193189.
- בימים 2 ו-3: שאפו את מדיום התרבית והוחלפו ב-100 מיקרוליטר של מדיום KSR בתוספת 10 מיקרומטר SB431542, 100 ננומטר LDN-193189, 5 מיקרומטר DAPT, 5 מיקרומטר SU5402, 1 מיקרומטר RA ו-1 מיקרומטר SAG.
- בימים 4 ו-5: הכינו מדיום מעורב המורכב מ-75% KSR בינוני ו-25% N2 בינוני (3.1.3). לאחר מכן, לשאוף את מדיום התרבית ולהחליף עם 100 μL של מדיום מעורב בתוספת 10 μM SB431542, 100 ננומטר LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA, ו 1 μM SAG.
- בימים 6 ו-7: הכינו מדיום מעורב המורכב מ-50% KSR בינוני ו-50% N2 בינוני. לאחר מכן, שאפו למדיום תרבית והחליפו אותו ב-100 מיקרוליטר של מדיום מעורב בתוספת 5 מיקרומטר DAPT, 5 מיקרומטר SU5402, 1 מיקרומטר חומצה רטינואית ו-1 מיקרומטר SAG.
- בימים 8 ו-9: הכינו מדיום מעורב המורכב מ-25% מדיום KSR ו-75% מדיום N2. לאחר מכן, יש לשאוף למדיום תרבית ולהחליף ב-100 μL של מדיום מעורב בתוספת 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA ו-1 μM SAG.
- בימים 10 ו-11: יש להחליף את המדיום ב-100 μl של N2 medium בתוספת 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA ו-1 μM SAG.
- ביום ה-12: המשך להעביר את ה-MNs לשבב תרבית הרקמה (שלב 6) או להחליף את המדיום ב-100 מיקרוליטר של מדיום ההתבגרות (3.1.4) בתוספת 20 ננוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF).
הערה: ניתן להעביר את MNS לשבב תרבית הרקמה החל מהיום ה-12 ועד היום ה-19. ספרואידים שאינם מועברים יש לשמור בתרבית ב 96 לוחות תחתונים U היטב במדיום התבגרות בתוספת 20 ng / mL BDNF עד להעברה.
6. הכנת שבב תרבית רקמה להיווצרות אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO)
- לעקר את PDMS מוכן (משלב 2.13) על ידי טבילתו 70% אתנול בצלחת פטרי לפחות 1 h.
הערה: יש לתפעל את כל השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגית.
- לעקר את זכוכית המיקרוסקופ (76 x 52 מ"מ) על ידי טבילתה באתנול 70% בצלחת פטרי.
- בתהליך הייבוש של זכוכית המיקרוסקופ, הניחו את מכשיר ה-PDMS על חצי זכוכית המיקרוסקופ הרטוב והניחו לה להתייבש לחלוטין על ידי המתנה למשך הלילה. לאחר שהוא מיובש לחלוטין, מכשיר PDMS צריך לדבוק זכוכית.
הערה: חיבור זה אינו קבוע כדי לאפשר ניתוק של מכשירי PDMS מזכוכית המיקרוסקופ לאחר התרבית לאיסוף רקמות. ניתן להשתמש בהדבקה קבועה על ידי פלזמה חמצן כדי למקסם את ההדבקה בין PDMS לזכוכית, אך היא תאסור על פירוק השבבים ואיסוף הרקמות.
- צפו את פני השטח של המיקרו-ערוץ במכשיר PDMS ובזכוכית מיקרוסקופ ב-30 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף מדוללת ב-DMEM/F12 (1:40) על-ידי יצירת טיפה בצד אחד של פתח התעלה, ולאחר מכן שאפו את התמיסה מהצד השני של הכניסה עם פיפטה או משאבת יניקה (איור 3A). אין לשאוף נפח גדול מדי של תמיסה כדי למנוע זיהום בועה.
- לאחר מכן, יש לדגור על מכשיר PDMS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C במיכל משני (למשל, צלחת פטרי).
7. היווצרות אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO)
- החלף את תמיסת הציפוי במדיום התבגרות שחומם מראש 150 מיקרוליטר בתוספת 20 ננוגרם/מ"ל BDNF ממש לפני השימוש.
- לאחר מכן, מקם את MNS משלב 5.2.9 לתוך הכניסה של microchannel באמצעות micropipette עם קצה רחב משעמם. MNS יכול להתיישב באופן ספונטני בתחתית המכשיר על ידי כוח הכבידה. אל תפעילו לחץ רב מדי בעת הזרקת MNS (איור 3B).
הערה: אם MNS תקוע על דופן של חור בשבב תרבית רקמה, בעדינות לשאוף את הפתרון מצד אחר של המפרצון.
- מלאו מאגר קטן (למשל, מכסה של צינור 15 מ"ל) במים סטריליים והניחו אותו בסמוך לשבב תרבית הרקמה במיכל המשני כדי למנוע אידוי בינוני. לאחר מכן, הניחו אותו באינקובטור של 5% CO2/37°C.
- לשינוי בינוני, שאפו את מדיום התרבית המותש ממרכז מאגר המדיום (איור 3C). אין לשאוף את כל המדיום והרקמה.
- הוסיפו בעדינות מדיום התבגרות טרי (עם BDNF). המדיום צריך להיות שונה כל 2-3 ימים. אין לייבש את מדיום התרבות בכל עת במהלך התרבות. אקסונים גדלים מ-MNS לתוך התעלה ומתאספים באופן ספונטני לצרור יחיד תוך 2-3 שבועות, מה שמביא להיווצרות MNO. MNO יכול להיות בתרבית במשך יותר מחודש אחד נוסף במכשיר.
