$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. תרביות תאים וקדם-התמיינות
- תרבית תאי גזע עצביים וקדם-דיפרנציאציה
- הכינו כיסויים מצופים פולי-D-ליזין. מכניסים כיסוי סטרילי (בקוטר 20 מ"מ) לצלחת בת 12 בארות. צפו את הכיסוי בפולי-D-ליזין, 0.1% w/v, במים להידבקות תאים טובה יותר על הכיסויים על ידי ביצוע השלבים הבאים.
הערה: יש לקבוע תנאים אופטימליים עבור כל קו תא ויישום.
- יש לצפות את פני השטח של הכיסוי בפולי-D-ליזין, 0.1% w/v, במים. נענעו בעדינות כדי להבטיח ציפוי אחיד של משטח הכיסוי.
- לאחר תרבית לילה (~ 12 שעות) ב 37 מעלות צלזיוס, להסיר את תמיסת פולי-D-ליזין ולשטוף את פני השטח 3x עם 1 מ"ל של מים סטריליים.
- יבשו את התאים לפחות 30 דקות לפני הזריעה.
- תאי גזע עצביים מורין C17.2 (C17.2-NSC) תרבית וקדם-התמיינות
- דגרו C17.2-NSCs בבקבוק25 ס"מ 2 במדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 5% סרום סוסים (HS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין ב-37°C ו-5% CO2 עבור ~2-3D.
- כאשר התאים מגיעים 85% מפגש, להסיר את המדיום, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS, ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין טרי (0.25%) לתוך הצלוחית. השאירו אותו למשך דקה; לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית לבקבוק ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח השעיה של תא יחיד.
- לספור את צפיפות התאים בהשעיה באמצעות המוציטומטר. חשב את הנפח הנדרש של תרחיף התא כדי לתת ריכוז תא סופי של 2 x 104 תאים / מ"ל.
- זרעו את C17.2-NSCs על הכיסויים המצופים בצלחת 12 בארות עם צפיפות של ~ 2 x 104 תאים לכל באר. בדוק את צפיפות התא תחת מיקרוסקופ.
הערה: לקבלת תוצאה טובה יותר, צפיפות התאים האופטימלית חייבת להיקבע לפני ניסוי האימונופלואורסצנטיות.
- יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של תאים למשך 12 שעות כדי לאפשר התקשרות.
- לאחר ההתקשרות, לשטוף את התאים 2x עם 1 מ"ל של PBS ולטפח את התאים עם מדיום התמיינות המורכב DMEM / F12 עם 1% N2 תוספת במשך 48 שעות לפני הטיפול פלזמה.
- תרבית תאי גזע עצבית ראשונית של חולדה וקדם-התמיינות
- תרבית תרחיף החולדה הראשוני NSC (תאי גזע עצביים) במדיום גידול NSC של חולדה בצלוחיות T25 לא מצופות בצפיפות של 5 x 105 תאים.
- בדוק את היווצרות נוירוספרות תחת מיקרוסקופ הפוך. ודא שהמורפולוגיה של הנוירוספרות מציגה קומפלקסים רב-תאיים כדוריים ושקופים.
- כאשר הנוירוספרות מגיעות לקוטר של 3 מ"מ ומעלה, העבירו את המתלה הנוירוספרי לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 15 מ"ל והניחו לנוירוספרות להתיישב על ידי כוח הכבידה.
- הסר את supernatant בזהירות להשאיר את neurospheres בנפח מינימלי של תווך.
- שטפו את הנוירוספרות 1x עם 5 מ"ל של PBS ותנו לנוירוספרות להתיישב על ידי כוח הכבידה. הסר את supernatant כדי להשאיר נפח מינימלי של PBS.
- הוסף נפח מתאים של מדיום התמיינות כדי להתאים את צפיפות התא ל~ 12 - 15 נוירוספרות למיליליטר. אמצעי ההתמיינות עבור NSCs ראשוניים של חולדות מורכב מ- DMEM/F12, 2% B27 ו- 1% FBS.
- זרע 1 מ"ל של תרחיף נוירוספירה על כל כיסוי מצופה בצלחת 12 בארות.
הערה: נערו את הצלחת בעדינות כדי לוודא שהנוירוספרות מפוזרות באופן שווה. שלב זה הוא קריטי לתוצאה אימונופלואורסצנטית טובה יותר.
- מניחים את הצלחת לתוך האינקובטור ומאפשרים לה להבדיל מראש במשך 24 שעות לפני טיפול הפלזמה.
2. הכנת סילוני הפלזמה
- בחר צינור קוורץ פתוח למחצה בקוטר פנימי של 2 מ"מ וקוטר חיצוני של 4 מ"מ. הכנס חוט מתח גבוה בקוטר של 2 מ"מ לתוך הצינור.
- הכנס את צינור הקוורץ עם חוט המתח הגבוה למזרק 5 מ"ל והשתמש במחזיק כדי להרכיב אותו בתוך מרכז המזרק. הגדר את המרחק בין הקצה האטום של צינור הקוורץ לבין קצה המזרק על 1 ס"מ.
- חברו צינור גומי סיליקון באורך 1 מ' (בקוטר פנימי של 12 מ"מ) לקצה הפתוח של המזרק ולאחר מכן חברו אותו למד הזרימה ולשסתום הגז ברצף.
3. רכישת הג'טס
- חברו את המעגל כפי שמוצג באיור 1. חבר את חוט היציאה של ספק הכוח להתקן סילון הפלזמה ולאחר מכן, חבר את קצה הבדיקה במתח גבוה עם חוט היציאה כדי לזהות את המתח. חבר את הקצה השני של בדיקת המתח הגבוה לאוסילוסקופ כדי להקליט את המידע של מתח היציאה. בדוק את כל המעגל וודא שספק הכוח, האוסילוסקופ וגשושית המתח הגבוה מוארקים כולם.
- בדוק את צינור הגז. ודא שצינור הגז מחובר למכשיר סילון הפלזמה; לאחר מכן, פתח את שסתום הגז של ההליום (חלק נפח, 99.999%) וחמצן (חלק נפח, 99.999%) והגדר את זרימת הגז ל- 1 L : 0.01 L/min (He:O2).
הערה: אפשר לגז לזרום במשך מספר דקות לפני שתפעיל את ספק הכוח בפעם הראשונה.
- הגדר את משרעת הפולס, התדר ורוחב הפולס כ- 8 kV , 8 kHz ו- 1600 ns, בהתאמה. בדוק את המעגל שוב ולאחר מכן, הפעל את לחצן הפלט כדי ליצור סילון פלזמה.
אזהרה: אין לגעת בחוט המתח הגבוה בכל עת.
4. טיפול פלזמה בתאי גזע עצביים
- הגדר את המרחק בין פיית המזרק לחור באר התא ל- 15 מ"מ.
הערה: המרחק נמדד מתחתית הרציף שבו ממוקמת צלחת 12 הקידוחים.
- מוציאים את צלחת 12 הקידוחים מהאינקובטור ומשנים את התווך של התאים הממוינים ל-800 מיקרוליטר של מדיום התמיינות טרי.
- חלקו את התאים לשלוש קבוצות: קבוצת ביקורת לא מטופלת, קבוצת טיפול בזרימת גז 60 s He-and-O2 (1%) וקבוצת טיפול פלזמה 60 s.
הערה: אין איבוד נוזלים ברור בתנאי הטיפול.
- מניחים את צלחת 12 הקידוחים מתחת לסילוני הפלזמה, מוודאים שפיית המזרק קבועה במרכז כל חור, ונותנים את הטיפול הרלוונטי לקבוצות השונות המוזכרות בשלב 4.3.
הערה: הבקרות שלא טופלו נשמרו במדיום התמיינות בטמפרטורת החדר במהלך הליך הניסוי כדי להבטיח תנאי טיפול אחידים. קבוצת הטיפול בזרימת גז He-and-O2 (1%) טופלה רק בזרימת גז He ו-O2 (1%), ללא יצירת פלזמה. כל הטיפולים צריכים להתבצע במשולש.
5. התמיינות תאי גזע עצביים
- לאחר הטיפול, להסיר את התרבות המקורית ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום בידול חדש לכל באר.
- לדגור על התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 במשך 6 ד'. החליפו את המדיום אחת ליומיים.
- בדקו את מצב ההתמיינות של הקבוצות השונות מדי יום תחת מיקרוסקופ אור הפוך עם ניגודיות פאזה איור 2. בחר באופן אקראי לפחות 12 שדות וצלם תמונות כדי לתעד את השינויים המורפולוגיים.
