יצירת מבשרי אינטרנוירון קורטיקליים מתאי גזע עובריים של עכברים

תקציר

מקור: Tischfield, D. J., et al התמיינות של תאי גזע עובריים של עכברים למבשרי נוירונים קורטיקליים. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מציג שיטה ליצירת מבשרי אינטרנוירונים קורטיקליים מתאי גזע עובריים של עכברים. הפרוטוקול כולל גידול תאי גזע במדיה המכילה מעכבי מולקולות קטנות ספציפיות, המאפשרים התרבות תאי גזע וצבירה לגופי עובר (EBs). לאחר מכן, EBs מנותקים עם אנזימים ומצופים על בארות צלחת תרבית מצופים חלבוני הידבקות כדי לקדם את התמיינותם למבשרי אינטרנוירון קליפת המוח.

פרוטוקול

1. הכנת מדיה

הערה: חממו את כל המדיה ל-37 ° C לפני השימוש בתרבית תאים.

1. מדיית פיברובלסט עוברי (MEF) של עכבר (להכנת 500 מ"ל)
   1. הוסף 50 מ"ל סרום בקר עוברי (FBS) ל- 449 מ"ל של מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco, וסנן דרך יחידת מסנן נקבוביות של 500 מ"ל 0.22 מיקרומטר.
   2. יש להוסיף 1 מ"ל חומר אנטי-מיקרוביאלי (50 מ"ג/מ"ל) לאחר הסינון. אחסן את המדיה ב 4 ° C עד חודש אחד או aliquot ואחסן ב ≤ -20 ° C.
2. מדיה N2 (להכנת 500 מ"ל)
   1. הוסף 5 מ"ל L-אלנין-L-גלוטמין (100x) ו-500 μL 2-מרקפטואתנול (55 מ"ל) ל-489.5 מ"ל DMEM: תערובת חומרים מזינים F-12 (DMEM/F-12), וסנן דרך יחידת מסנן נקבוביות של 500 מ"ל 0.22 מיקרומטר.
   2. יש להוסיף 1 מ"ל חומר אנטי-מיקרוביאלי (50 מ"ג/מ"ל) ו-5 מ"ל תוסף N2-B לאחר סינון. אחסן את המדיה בטמפרטורה של 4°C בחושך למשך עד חודש אחד.
3. מדיום גידול ללא סרום (KSR) (להכנת 500 מ"ל)
   1. הוסף תוסף בינוני ללא סרום 75 מ"ל, 5 מ"ל L-גלוטמין (100x), 5 מ"ל MEM חומצות אמינו לא חיוניות (MEM-NEAA) (100x), ו 500 μL 2-Mercaptoethanol (55 mM) ל 413.5 מ"ל שאינו גלוטמין המכיל DMEM, וסנן דרך 500 מ"ל 0.22 מיקרומטר יחידת מסנן נקבוביות.
   2. יש להוסיף 1 מ"ל חומר אנטי-מיקרוביאלי (50 מ"ג/מ"ל) לאחר הסינון. אחסן את המדיה ב- 4 ° C למשך עד חודש אחד.
4. מצע תאי גזע עובריים של עכבר (להכנת 500 מ"ל)
   1. הוסף 75 מ"ל FBS בדרגת תאי גזע, 5 מ"ל MEM-NEAA (100x), 5 מ"ל L-גלוטמין (100x) ו-500 μL 2-מרקפטואתנול (55 מ"ל) ל-413.5 מ"ל שאינו מכיל DMEM, וסנן דרך יחידת מסנן נקבוביות של 500 מ"ל 0.22 מיקרומטר.
   2. יש להוסיף 1 מ"ל חומר אנטי-מיקרוביאלי (50 מ"ג/מ"ל) לאחר הסינון. אחסן את המדיה ב 4 ° C בחושך עד 1 חודש או aliquot ואחסן ב ≤ -20 ° C.

2. גידול mESCs

1. צלחת תאי מזין MEF לא פעילים מיטוטית במדיה MEF על לוחות שטופלו בתרבית רקמות ב 3-4 x 10⁴ תאים / ס"מ². הקדישו לפחות 12 שעות עבורם להתיישב באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C עם לחות יחסית של ≥ 95% ו-5% CO₂ לפני ציפוי ה-mESCs. אם לא נעשה שימוש מיידי, יש להחליף את מדיית MEF כל 3 ימים. יש להשליך MEFs אם לא נעשה בהם שימוש תוך 7 ימים מהציפוי.
2. הוסף mESCs (טווח צפיפות בין 1-4 x 10⁴ תאים/ס"מ²) ללוחות MEF במדיה mESC המכילה גורם מעכב לוקמיה של עכבר (mLIF) (1,000 U/mL). לדגור על התאים ב 37 ° C עם ≥ 95% לחות יחסית ו 5% CO₂.
3. מעבר mESCs באמצעות טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין) (1:5-1:10) ברגע שהמנה הופכת ~ 70-80% למפגש או אם המושבות מתחילות לגעת. זה קורה בדרך כלל כל יומיים אבל יכול לקחת עד 4 או 5 ימים, בהתאם לצפיפות הציפוי הראשונית.
4. שמרו על תאי גזע עובריים עובריים עובריים (mESC) על שכבת מזין MEF בתווך mESC כדי לשמור על פלוריפוטנטיות.
5. לפני תחילת ההתמיינות, העבירו את התאים לפחות פעם אחת על לוחות מצופים ג'לטין ללא MEFs כדי לדלל את MEFs.​
   1. הכינו צלחות מצופות ג'לטין על ידי הוספת 0.1% ג'לטין במי מלח חוצצים פוספט (PBS) עם Ca²⁺/Mg²⁺ לצלחת שטופלה בתרבית רקמה והשאירו בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת לפחות. צלחת 1.5-2 x 10⁶ תאים / צלחת 10 ס"מ (2.7-3.6 x 10⁴ תאים / ס"מ²) ולאפשר לתאים להתרחב במשך יומיים לפני תחילת ההתמיינות.

3. הבחנה בין mESCs כלפי אבות טלנצפליים דמויי MGE

1. יום התמיינות (DD) 0 = "תאים צפים"
   1. לאחר שה-mESCs גדלו על צלחות מצופות ג'לטין במשך יומיים, שאפו את המדיה ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS ללא Ca²⁺/Mg²⁺. הוסיפו מספיק טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין) כדי לכסות את פני הצלחת (בדרך כלל 4 מ"ל טריפסין-EDTA עבור צלחת תרבית רקמה אחת של 10 ס"מ), והחזירו את התאים לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם לחות יחסית של ≥95% ו-5% CO₂ למשך 4 דקות.
   2. לאחר 4 דקות, להרוות את טריפסין-EDTA באמצעות פי 2 נפח עם מדיה mESC. מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה בגודל מתאים וצנטריפוגות את התאים ב 200 x גרם למשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, להסיר את הצינור ולשאוף את התקשורת מבלי להפריע את הכדור. השהה מחדש את הגלולה במדיה 1 מ"ל KSR:N2 (1:1) המכילה את מעכב BMP LDN-193189 (250 ננומטר) ואת מעכב Wnt XAV-939 (10 מיקרומטר).
   3. מדוד את ריכוז התא באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. התחל לגדל תאים כגופים עובריים (EBs) על ידי הוספת 75,000 תאים/מ"ל במדיה KSR:N2 (1:1) המכילה LDN-193189 (250 ננומטר) ו- XAV-939 (10 מיקרומטר) בצלחות תרבית רקמה לא דבקות. לדגור על התאים ב 37 ° C עם ≥ 95% לחות יחסית ו 5% CO₂.
2. ב-DD1, יש להתכונן ל"נחיתה" של תאים על ידי ציפוי כלים שטופלו בתרבית רקמה בפולי-ל-ליזין (10 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS עם Ca²⁺/Mg²⁺) למשך הלילה (O/N) ב-37°C עם לחות יחסית של ≥ 95% או למשך שעה אחת לפחות.
3. ב-DD2, שאפו את הפולי-L-ליזין וציפו את הלוחות בלמינין (10 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS עם Ca²⁺/Mg²⁺) O/N ב-37°C עם ≥ 95% לחות יחסית.
   הערה: בעוד O/N הוא אופטימלי, רק 2 שעות עשוי להיות מספיק. אם לא משתמשים בצלחות עד למחרת, יש לשאוף למינין, להחליף ב-PBS ללא Ca²⁺/Mg²⁺, ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
4. DD3 ("תאי יבשה")
   1. לפני תחילת דיסוציאציה EB, לשאוף את הלמינין ולאפשר את הצלחות להתייבש לחלוטין במכסה מנוע תרבית רקמה. אין להשתמש בצלחות שנראות מבריקות או רטובות באופן ניכר. העבר את EBs עם מדיה לתוך צינור 15 מ"ל וצנטריפוגה במשך 3-4 דקות ב 15 x גרם או עד EBs יש pellet.
5. יש לשאוף את המדיה ולהוסיף 3 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים המכילה DNase (2 U/mL) ולדגור בטמפרטורה של 37°C עם לחות יחסית של 95% ≥ ו-5% CO₂ למשך 15 דקות. יש לסובב את הצינורית בעדינות כל 3 דקות כדי לסייע בדיסוציאציה של EB.
6. לאחר שה- EBs אינם גלויים עוד או שחלפו 15 דקות, הוסף 6 מ"ל KSR:N2 (1:1) המכיל DNase (1 U/mL) וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 200 x גרם.
7. לוחית את התאים ב- KSR:N2 (1:1) המכילים LDN-193189 (250 ננומטר), XAV-939 (10 מיקרומטר) ומעכב ROCK Y-27632 (10 מיקרומטר) ב- 4.5-5 x 10⁴ תאים/ס"מ².

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פיברובלסטים עובריים של עכבר (CF-1 MEF IRR 7M)	MTI-גלובלסטם	GSC-6101G	בקבוקון אחד של 7M MEFs מספיק לארבעה לוחות TC בקוטר 10 ס"מ.
פ.ב.ס.	אטלנטה ביולוגיה	S11150H
פרימוצין	אינוויווגן	Ant-pm-2	ידוע גם בשם סוכן מיקרוביאלי. אין לסנן עם מדיית בסיס - יש להוסיף לאחר הסינון.
תוספת N2-B	טכנולוגיות תאי גזע	7156	אין לסנן עם מדיית בסיס - להוסיף לאחר הסינון
גלוטמקס (100x)	תרמופישר	35050061	ידוע גם בשם L-אלנין-L-גלוטמין.
החלפת סרום נוקאאוט (KSR)	תרמופישר	10828028	ידוע גם בשם תוסף בינוני ללא סרום.
L-גלוטמין (100x)	תרמופישר	25030081
MEM-NEAA (פי 100)	תרמופישר	11140050
2-מרקפטואתנול	תרמופישר	21985023
נוקאאוט DMEM	תרמופישר	10829018
היקלון FBS	VWR	82013-578	ידוע גם בשם FBS כיתה תאי גזע.
צלחת מטופלת בתרבית רקמות (10 ס"מ)	BD בז	353003
צלחת פטרי סטרילית לא דבקה (10 ס"מ)	VWR	25384-342
גורם מעכב לוקמיה (mLIF)	כימקון	ESG1107	אין להקפיא, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
DMEM/F12	תרמופישר	11330032
0.1% תמיסת ג'לטין	ATCC	ATCC PCS-999-027
למינין	סיגמא	L2020
פולי-ל-ליזין	סיגמא	עמ' 6282
טריפסין-EDTA (0.05%)	תרמופישר	25300054
אקוטאזה	תרמופישר	A1110501	ידוע גם בשם מגיב שאינו טריפסין המכיל דיסוציאציה של תאים.
RQ1 DNase ללא RNase	פרומגה	M610A
LDN-193189	סטמג'נט	04-1974	השהה מחדש ב- DMSO ואחסן ב -80'C ב- aliquots לשימוש יחיד
XAV939	סטמג'נט	04-1946	השהה מחדש ב- DMSO ואחסן ב -80'C ב- aliquots לשימוש יחיד
מעכב סלעים (Y-27632)	טוקריס	1254	השהה מחדש ב- DMSO ואחסן ב -80'C ב- aliquots לשימוש יחיד