יצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים של עכבר בשיטת הטיפה התלויה

תקציר

מקור: Hanafiah, A., et al. התמיינות ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכברים. J. Vis. Exp. (2020).

הסרטון מדגים את ההתמיינות של תאי גזע עובריים של עכברים (mESCs) לגוף עוברי (EBs) בשיטת הטיפה התלויה. עם השעיית תאי גזע עובריים בטיפות תלויות ודגירה, התאים מצטברים ליצירת EBs, אשר מתמיינים עוד יותר לתאי אב עצביים (NPCs) באמצעות מדיום התמיינות בתוספת חומצה רטינואית (RA).

פרוטוקול

1. תרבות mESC

1. מצפים צלחת בגודל 10 ס"מ שטופלה בתרבית רקמות עם 0.1% ג'לטין ומניחים לג'לטין להתייצב לפחות 15-30 דקות לפני ששואפים אותו החוצה.
2. זרעו פיברובלסטים עובריים של עכברים γ מוקרנים (MEFs) יום אחד לפני תרבית תאי גזע עובריים עובריים עובריים (בעלי תאי גזע עובריים) בעלי תאי גזע עובריים (MFEM) שחוממו מראש (מדיום הנשר המעובד (DMEM) עם 15% נסיוב בקר עוברי (FBS), חומצות אמינו לא חיוניות, β-מרקפטואתנול, L-גלוטמין, פניצילין/סטרפטומיצין, נתרן פירובט, גורם מעכב לוקמיה (LIF), PD0325901 (PD) ו-CHIR99021 (CH)).
3. אפשרו ל-MEFs המוקרנים γ לשקוע ולהיצמד למשטח הצלחת לפני תרבית תאי E14.
4. הפשיר E14 ESCs באמבט מים 37 ° C במהירות להעביר את התאים בצינור חרוטי 15 ס"מ עם mESC חם בינוני. משחררים את התאים ב 200 x גרם במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.
5. השהה מחדש את התאים ב -10 מ"ל של מדיום mESC וצלחת את התאים על צלחת התרבית המכילה את MEFs המוקרנים γ שנזרעו קודם לכן. לדגור על תרבית התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO₂.
6. למעבר תרבית, שאפו את המדיום ושטפו את הצלחת במי מלח סטריליים 1x פוספט חוצץ (PBS). הוסיפו מספיק 0.05% טריפסין כדי לכסות את פני הצלחת ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 3 דקות.
7. נטרלו את הטריפסין עם מדיום mESC ופיפטה כדי ליצור תרחיף חד-תאי. צנטריפוגו את התאים ב 200 x גרם במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.
8. לספור את התאים עם hemocytometer או מונה תאים זרע על 5.0 x 10⁵ תאים בצלחת תרבית 10 ס"מ.
9. להשהות מחדש את התאים ב 10 מ"ל של מדיום mESC, צלחת את התאים על צלחת תרבית רקמה מצופה ג'לטין לדגור תרביות כפי שתואר קודם לכן.
   הערה: מומלץ לעבור mESCs כל יומיים כדי למנוע מהתאים להתמיין במושבות שלהם. פנול אדום במדיום מתפקד אך ורק כאינדיקטור pH ובהתאם לצפיפות התאים, הוא יכול להפוך צהבהב (חומצי יותר), מוקדם יותר מ 2 ימים. לפיכך, ייתכן שיהיה צורך לשנות את המדיום כל יום. ה-MEFs המוקרנים γ ימותו בסופו של דבר לאחר כמה מעברים.

2. EB, NPC והתמיינות נוירונים

1. בצע פרוטוקול העברת תרבית וספור את התאים.
2. שיטת נפילה תלויה (יום 0)
   1. עבור צלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ, יש לספור בערך 2.5 x 10⁴ תאים שבהם 5.0 x 10² תאים יהיו מרחפים בתווך התמיינות של 20 μL (DMEM עם 15% FBS, חומצות אמינו לא חיוניות, β-מרקפטואתנול, L-גלוטמין, פניצילין/סטרפטומיצין ונתרן פירובט). בערך חמישים טיפות 20 μL המכילות את התאים ניתן לצפות על צלחת אחת 10 ס"מ.
   2. Aliquot את מספר התאים המתאים, ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.
   3. השהה מחדש את התאים בנפח המתאים של מדיום התמיינות עבור צפיפות תאים של 5.0 x 10² תאים לכל 20 μL (למשל, 2.5 x 10⁴ תאים ב 1 מ"ל של מדיום התמיינות).
   4. בעזרת מיקרופיפטה או פיפטה חוזרת, מניחים 20 טיפות μL של תרחיף התא על מכסה צלחת תרבית הרקמה. ודא שהטיפות אינן קרובות מדי זו לזו כדי למנוע מהן להתמזג.
      הערה: ניתן לצפות את הטיפות על צלחת חיבור המטופלת בתרבית רקמות או על צלחת תלייה, מכיוון שהן יונחו על המכסה ולא על הצלחת עצמה. לגישה מעשית וסטרילית יותר, לוחצים את הטיפות על צלחת תרבית רקמה מחוברת ומעבירים אותן לצלחת תרחיף כמתואר להלן.
   5. מלאו את הצלחת ב-5-10 מ"ל של 1x PBS והחזירו בזהירות את המכסה לצלחת. לדגור על התרבית בחממה 37 °C.
      הערה: PBS מתווסף לצלחת התרבית כדי למנוע מהטיפות להתייבש.
3. ביום השני, השתמשו במיקרופיפטה כדי לאסוף את הטיפות מהמכסה והניחו אותן בצלחת תרחיף תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ מלאה במדיום התמיינות של 10 מ"ל. לדגור את התרבית על שייקר מסלולי, רועד במהירות נמוכה באינקובטור.
4. ביום 4, כדי לקצור את EBs, לאסוף את התאים, צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 3 דקות, ולהסיר את supernatant.
   הערה: ניתן גם לשטוף את ה- EBs עם PBS 1x בהתאם לדרישות הניסויים הבאים.
5. כדי להמשיך את ההליך ולגרום להתמיינות EB לתאי אב עצביים (NPCs), הכינו את מדיום ההתמיינות עם חומצה רטינואית (RA) של 5 מיקרומטר.
6. הסר את המדיום הישן על ידי כדורי EBs ב 100 x גרם במשך 3 דקות או לאפשר EBs לשקוע לפני לשאוף החוצה את המדיום הישן. הוסף 10 מ"ל של מדיום בידול המכיל 5 מיקרומטר RA לצלחת התרבית.
7. ביום השישי, יש להחליף לפחות מחצית מהתווך בתווך טרי המכיל 5 מיקרומטר RA על ידי הטיית הצלחת והוצאת המדיום כמתואר לעיל.
   הערה: מומלץ להחליף לפחות מחצית מהמדיום בתווך טרי המכיל RA בימים 5 ו-7. שימו לב למחוון האדום פנול; אם הוא הופך צהבהב, עדיף להחליף את כל המדיום.
8. ביום 8, קצרו את NPCs על ידי איסוף התאים, צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 3 דקות, והסרת supernatant.
   הערה: NPCs ניתן גם לשטוף עם 1x PBS על פי הצרכים של ניסויים הבאים. במידת הצורך, NPCs ניתן להקפיא ולהפשיר שוב עבור תרבית וניתוח מאוחר יותר. אם NPCs הם להיות בתרבית, accutase יכול לשמש גם כחלופה טריפסין.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.05% טריפסין + 0.53mM EDTA 1X	קורנינג	25-052-CV
0.1% ג'לטין	סיגמא	G1890-100G	מוכן במים דה-יוניים
CHIR99021	קיימן כימיקלים	13122
DMEM	קורנינג	10-017-ס"מ
DMEM/F12 בינוני	תרמו פישר סיינטיפיק	11320033
מאגר EB	קיאגן	19086
אתנול	111000200	פארמקו	מדולל במים דה-יוניים
סרום בקר עוברי	אטלנטה ביולוגיה	S10250
ל-גלוטמין	תרמו פישר סיינטיפיק	25030024
ליף	לא ישים	לא ישים	נאסף מסופרנאטנט MEF
MEM חומצות אמינו לא חיוניות	קורנינג	25-025-CL
PD0325901	קיימן כימיקלים	13034
פניצילין/סטרפטומיצין	קורנינג	30-002-CL
מלח חוצץ פוספט (PBS)	לא ישים	לא ישים	מוכן במים דה-יוניים
אשלגן כלורי	P217-500G	VWR
אשלגן פוספט monobasic נטול מים	0781-500 גרם	VWR
נתרן כלורי	BP358-10	פישר ביוריאגנטים
נתרן פוספט, דו-בסיסי, הפטהידראט	SX0715-1	מיליפורה
חומצה רטינואית	סיגמא	₪625	הוכן ב-DMSO
נתרן פירובט	קורנינג	25-000-סנטל'
β-מרקפטואתנול	פישר ביוריאגנטים	BP176-100