השתקת גנים בתיווך siRNA בתאי גזע עצביים

תקציר

מקור: Nguyen, B. H., et al. גידול ומניפולציה של תאי קרסט עצביים O9-1. J. Vis. Exp (2018)

סרטון זה מדגים את השימוש ב-RNA מפריע קטן (siRNA) כדי להשתיק גנים ספציפיים בעלי עניין בתאי גזע עצביים ולהתמיין אותם לסוגי תאים רצויים באמצעות אמצעי התמיינות מתאים. הליך זה מאפשר לחקור את התפקיד הקריטי של גנים ספציפיים בתהליך ההתמיינות של תאי גזע עצביים.

פרוטוקול

1. מניפולציה של תאי O9-1

1. ביצוע הפלת siRNA בתאי O9-1
   1. הפשירו וציפו צלחת בת 24 בארות במטריצת קרום מרתף לפני תחילת הניסוי. להתאושש ולזרוע תאים O9-1, המאפשר להם לגדול 60% עד 80% מפגש.
   2. יש לדלל ליפוזומים במדיה נטולת סרום בהתאם לנפח הבאר המתאים. לדלל siRNA במדיה ללא סרום עד לגמר. הוסף siRNA מדולל לליפוזומים מדוללים ביחס המומלץ על ידי היצרן. מערבבים היטב על ידי pipetting ולאחר מכן incute.
      הערה: עקוב אחר מדריך היצרן לגבי הנפח שבו נעשה שימוש, הזמן והטמפרטורה של הדגירה.
   3. הוסף נפח מתאים של קומפלקס siRNA-שומנים לתאים בהתאם להמלצות היצרן.
   4. לדגור על תאים במשך 24 שעות באינקובטור תרבית תאים סטנדרטי (37°C, 5% CO₂). בצע שלבים במורד הזרם לפי הצורך (מיצוי RNA, מיצוי חלבונים, צביעה וכו ')
      הערה: זמני ההפלות והריכוזים של siRNA עשויים להשתנות בהתאם לניסוי הבודד.

2. התמיינות תאים O9-1

1. התמיינות של תאי O9-1 לאוסטאובלסטים
   1. כדי להכין אמצעי התמיינות אוסטאוגניים, יש לדלל את הדברים הבאים באלפא-MEM (הריכוזים הסופיים מצוינים): 0.1 מיקרומטר דקסמתזון, 100 ננוגרם/מ"ל חלבון מורפוגנטי עצם 2 (BMP2), 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית, 10 מ"מ בי גליצרופוספט, 10% FBS, 100 U/מ"ל פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין.
   2. זהו את סמן האוסטאובלסט, אוסטאוקלצין, באוסטאובלסטים ממוינים על-ידי צביעה חיסונית, כפי שמוצג באיור 1.
      הערה: ניתן להעריך התמיינות אוסטאוגנית גם באמצעות סמנים אחרים של אוסטאובלסטים או עם צביעה אדומה של אליזרין או צביעת פוספטאז בסיסית.
2. התמיינות תאי O9-1 לתאי שריר חלק
   1. כדי להכין אמצעי התמיינות תאי שריר חלקים, לדלל את הדברים הבאים ב- DMEM (הריכוזים הסופיים מצוינים): 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו -10% FBS.
   2. מעריך התמיינות של תאי שריר חלק עם צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות נוגדנים כנגד סמנים של תאי שריר חלק, כגון אקטין שריר חלק (SMA), שמוצג כדוגמה באיור 2.

תוצאות

איור 1: צביעה אימונופלואורסצנטית של סמן אוסטאובלסט אוסטיאוקלצין (Ocn) המצביעה על כך שתאי O9-1 הולידו תאי אוסטאובלסטים בתנאי התמיינות אוסטאוגניים. התאים הוכתמו בנוגדן Ocn (ירוק), והגרעינים הוכתמו ב-DAPI (כחול). חצים מציינים תאים חיוביים ל-Ocn. אוסטיאוקלצין (Ocn, סמן אוסטאובלסט); DAPI (′,6-diamidino-2-phenylindole).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
O9-1 עכבר גולגולתי קו תאי קרסט עצבי	מיליפור סיגמא	SCC049
DMEM, גלוקוז גבוה, ללא גלוטמין	גיבקו	11960-044
DMEM, גלוקוז גבוה	היקלון	SH30243.01
FBS (נסיוב בקר עוברי)	מיליפור סיגמא	ES-009-B
פניצילין - סטרפטומיצין	גיבקו	15140-122
ל-גלוטמין 200mM (100X)	גיבקו	25030-081
טריפסין-EDTA 0.25% ב-HBSS	ג'נסי סיינטיפיק	25-510
DPBS (מלח חוצץ פוספט של Dulbecco) ללא סידן או מגנזיום	לונזה	17-512F
MEM חומצות אמינו לא חיוניות (MEM NEAA) 100X	גיבקו	11140-050
נתרן פירובט (100mM)	גיבקו	11360-070
2-מרקפטואתנול	סיגמא	M-7522
גורם גדילה פיברובלסטים אנושי רקומביננטי-בסיסי (rhFGF-basic)	מערכות מו"פ	233-FB-025
מיטומיצין C	רוש	10107409001
מטריצת מטריגל	קורנינג	356234
DMSO (דימתיל-סולפוקסיד)	מיליפור סיגמא	MX1458-6
ליפופקטמון RNAiMAX	תרמו פישר סיינטיפיק	13778-075
Opti-MEM I (1X)	גיבקו	31985-070
מדיום חיוני מינימלי, אלפא 1X עם מלחי ארל, ריבונוקלאוזידים, דאוקסיריבונוקלאוזידים ו-L-גלוטמין	קורנינג	10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA	דהרמקון	L-041057
מאגר On-TARGETplus ללא פילוח	דהרמקון	D-001810
על TARGETplus Yap1 siRNA	דהרמקון	L-046247
FCS (נסיוב עגל עובר)
ITS (אינסולין-טרנספרין-סלניום)
TGF-b3
חומצה אסקורבית
BMP2 (חלבון מורפוגנטי עצם 2)
דקסמתזון
תוספת B-27