בידוד מושבות תאי אב עצביים המושרים שמקורם בפיברובלסטים אנושיים בוגרים

תקציר

מקור: Meyer, S. et al., גזירה של פיברובלסטים אנושיים בוגרים והפיכתם הישירה לתאי אב עצביים הניתנים להרחבה.J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד תאי אב עצביים מושרים (iNPCs) שמקורם בפיברובלסטים אנושיים בוגרים. הוא מתאר את הצעדים הכרוכים בבידוד מושבות iNPC וגידולן בבארות מרובות בארות מצופות למינין בנוכחות אמצעי תרבות מתאימים המאפשרים את המשך ההתרבות וההתרחבות של אוכלוסיית iNPC.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. בידוד מושבות תאי אב עצביים מושרים (iNPC)

1. יום אחד לפני קטיף מושבות iNPC, צפו צלחת אחת של 48 בארות בלמינין: דללו למינין ל-1 מיקרוגרם/מ"ל במי מלח חוצצי פוספט (DPBS) של Dulbecco, הוסיפו 300 μl של התמיסה לצלחות, ושמרו על טמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות. יום לאחר מכן, שאפו למינין מהצלחות והוסיפו 200 μl של מדיה נוירואינדוקציה (1:1 DMEM/F-12:Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng/ml גורם מעכב לוקמיה אנושית, 3 μM CHIR99021, 2 μM SB431542) לבארות.
2. שטפו את 6 הצלחות המכילות את המושבות לקטוף פעם אחת עם DPBS והוסיפו 2 מ"ל מדיה נוירואינדוקציה לכל באר של 6 צלחת היטב. בחרו את המושבות באופן מכני: גרדו סביב מושבות באמצעות מחט דקה כדי להיפטר מהתאים שמסביב; הגדר את הפיפטמן 200 μl על 50 μl ובחר את המושבות באמצעות קצות פיפטה בהתאמה.
3. מעבירים מושבה אחת כל אחת לבאר אחת של צלחת 48 מצופה למינין ויוצרים באופן מכני תרחיף תא בודד על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים. הוסף מעכב ROCK Y27632 בריכוז סופי של 10 מיקרומטר לתאים.
4. לגדל את התאים על צלחת 48 היטב ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 2 ימים. שנה את המדיה כל יום שני עד שהתאים מגיעים למפגש של 80 - 90% (כ -3 - 4 ימים).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
CHIR99021	אקסון medchem	1386
DMEM F12	לייף טכנולוגיות	11320-033
DPBS	לייף טכנולוגיות	14190-094
גלוטמקס	לייף טכנולוגיות	35050-038
hLIF	פפרוטק	300-05
למינין	סיגמא	L2020
N2	לייף טכנולוגיות	17502-048
נוירובזל	לייף טכנולוגיות	21103-049
SB431542	אינוויווגן	INH-SB43
Y27632	קלביוכם	CAS 146986-50-7
B27	לייף טכנולוגיות	17504-044