$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת לוחות 24 בארות לתרביות נוירונים בצפיפות גבוהה
הערה: בצע את השלבים הבאים (2-3) יום לפני קציר העוברים המתוכנן.
- הכניסו שתי צלחות בנות 24 בארות למכסה המנוע של תרבית התאים ופתחו את האריזה הנפרדת.
- חבר מחט מזרק 18 גרם למזרק פלסטיק חד פעמי בנפח 1 מ"ל.
- החזיקו את המזרק וכוונו את קצה המחט ב~1 מ"מ שמאלה למרכז תחתית הבאר. הפעל כוח מתון (~ 250 גרם) כדי לחרוט את תחתית הבאר (~ 1 מ"מ אורך). ייווצר חריץ, והחומרים הפלסטיים שנעקרו ייצרו תמיכה מוגבהת מעל משטח הבאר התחתון השטוח. חרטו חריץ מקביל נוסף ~1 מ"מ באורך ~1 מ"מ מימין למרכז התחתון באופן דומה.
- חזור על שלב זה עבור כל הבארות של שתי הצלחות של 24 בארות. שתי הצלחות בנות 24 הקידוחים המשמשות לתרבית בצפיפות גבוהה מוכנות כעת לציפוי בפולי-D-ליזין (ראה שלב 2.8 להלן).
2. הכנת כיסויים לתרביות נוירונים בצפיפות נמוכה
- השתמש בקוטר 12 מ"מ #1 זכוכית עגולה.
- יש להניח 50 כיסויים בתוך צלחת פטרי סטרילית מפלסטיק סטרילי בקוטר 100 מ"מ ולטבול את החלקות בתמיסת אתנול 70% בנפח 20 מ"ל. מניחים צלחת פטרי זו על פלטפורמה מסתובבת עם סיבוב מתון (70 סל"ד) מהירות במשך שעה. הסר 70% אתנול ולאחר מכן החלף באצווה טרייה של 70% אתנול. מסובבים ושוטפים עוד שעה.
- יש להשליך תמיסת ניקוי אתנול 70%. מוסיפים מים סטריליים (מסוננים דרך יחידת סינון 0.2 מיקרומטר). שטפו את הכיסויים בקפדנות על ידי סיבוב צלחת הפטרי ביד. יש לשטוף שלוש פעמים, ובכל פעם להחליף במים סטריליים טריים.
- מניחים את צלחת הפטרי עם כיסויים בתוך מכסה מנוע של תרבית תאים סטרילית עם זרימה למינרית. שאפו את מי השטיפה דרך קו הוואקום והוסיפו 10 מ"ל מים סטריליים מסוננים כדי לטבול את הכיסויים. הכיסויים צריכים להיות סטריליים, והמשטח צריך להיות נקי מספיק לציפוי פולי-D-ליזין.
- פתחו שתי צלחות בנות 24 בארות מהאריזה האישית שלהן והניחו אותן במכסה המנוע.
- הפעל את קו הוואקום במכסה המנוע. חברו קצה פיפטה של 200 μl לקו הוואקום והשתמשו במספריים כדי לחתוך את הקצה ליצירת פתח גדול יותר.
- השתמשו בפינצטה #5 עדינה כדי לאסוף כיסויים מצלחת הפטרי, אחד בכל פעם, והשתמשו בקו הוואקום כדי לייבש לחלוטין את הכיסוי. לאחר מכן מניחים כיסוי אחד לכל אחת מהבארות של צלחת 24 הבארות. 50 הכיסויים המנוקים אמורים להספיק כדי למלא כל אחת מהבארות של שתי הצלחות בנות 24 הבארות.
- דללו את תמיסת מלאי פולי-D-ליזין (1 מ"ג/מ"ל) לתמיסת עבודה (0.1 מ"ג/מ"ל) עם חיץ בוראט (pH 8.5). עבור ארבע צלחות 24 בארות (כולל שתי צלחות בצפיפות גבוהה עם תחתית חרוטה), להכין 30 מ"ל של פתרון עבודה כולל.
- הוסף 300 μl 0.1 מ"ג / מ"ל פתרון עבודה פולי-D-ליזין לכל באר עם כיסויי זכוכית. ודא שהכיסויים שקועים לחלוטין בתמיסה. אם לא, השתמש בקצה הפינצטה #5 כדי ללחוץ על הכיסויים כלפי מטה בתחתית הבאר, והשתמש בקצה כדי להנחות את תמיסת פולי-D-ליזין כדי לכסות את כל פני השטח של הכיסויים. בדוק חזותית את כל החלקות הכיסויים כדי לוודא שלא נלכד אוויר בין הצלחת לכיסויים.
- הוסף 300 μl 0.1 מ"ג / מ"ל תמיסת עבודה פולי-D-ליזין לכל באר של צלחת תרבית בצפיפות גבוהה עם תחתית חרוטה. סובבו ביד כדי להפיץ את התמיסה כדי לכסות את כל החלק התחתון של הבאר.
- להחזיר את כל ארבע הצלחות עם פולי-D-ליזין לחממת התרבית, ולדגור O/N.
3. צלחות כביסה ומיזוג מראש לתרבות
הערה: השלבים הבאים (3-5) מתבצעים ביום קציר הרקמות.
- לאחר דגירה/ציפוי של כיסויים וצלחות O/N של 24 בארות, הביאו את כל ארבע הצלחות (שתיים עם כיסויי תורם, שתי צלחות קבלות בצפיפות גבוהה עם תחתית פלסטיק חרוטה ) לתוך מכסה המנוע של התרבית. השתמש בקו הוואקום כדי להסיר את תמיסת פולי-D-ליזין.
- מיד לאחר הסרת תמיסת פולי-D-ליזין, הוסף ~ 1 מ"ל מים סטריליים לכל באר באמצעות פיפטה העברת פלסטיק. אחרי כל הבארות מלאים במים, תן לעמוד במשך 10 דקות. מוציאים מים על ידי ואקום, ולאחר מכן מוסיפים 300 μl לשטוף בינוני בכל באר כדי לכסות את תחתית הבאר (עם או בלי זכוכית מכסה חלקות). אין לתת לציפוי פולי-D-ליזין להתייבש.
- מחזירים את כל ארבע הצלחות לאינקובטור התא. הצלחות מוכנות לשימוש ברגע שתאי העצב המפוזרים בהיפוקמפוס מוכנים.
4. ציפוי נוירונים ותרבות משותפת ארוכת טווח
- הביאו את שתי הצלחות בנות 24 הבארות עם תחתית חרוטה עבור תאי עצב בצפיפות גבוהה לתוך מכסה התרבית של תרבית התא. הסר את התנאי המקדים 300 μl על ידי ואקום. צלחת 0.6 מ"ל תרחיף תאים בצפיפות גבוהה ב 250,000 נוירונים / מ"ל.
- הכניסו את שתי הצלחות האחרות בנות 24 הבארות עם הכיסויים למכסה המנוע של התרבית והסירו את מדיום התנאי המוקדם של 300 μl באמצעות ואקום. צלחת 0.6 מ"ל תרחיף תאים בצפיפות נמוכה ב 10,000 נוירונים / מ"ל על הכיסויים בתוך שתי צלחות 24 באר.
- החזירו את כל ארבע הצלחות בנות 24 הקימורים לאינקובטור. תן לשבת במשך 2 שעות.
- הפוך את הכיסויים בצפיפות נמוכה עם תאי עצב נצמדים לתרבית בצפיפות גבוהה. ודאו שתאי העצב עומדים זה מול זה (כלומר, אינם מופרדים על ידי כיסוי הזכוכית). לאחר מכן החזירו את שתי הצלחות עם תרבות משותפת לחממה.
5. תרבות משותפת קיום
- להאכיל תרביות משותפות על ידי הוספת 300 μl טרי Feed בינוני (ראה חומרים) ביום במבחנה (DIV) 5. אין צורך להסיר 50% ממדיום התרבות השלם המקורי, כפי שדווח על ידי מחקרים רבים אחרים. אמצעי ההזנה מכיל גם 15 מיקרומטר ציטוזין ארבינוזיד (Ara-C, כדי להניב ריכוז סופי של 5 מיקרומטר) כדי למזער את הסיכוי לזיהום גליה והתפשטות.
- לאחר האכלה ראשונית זו, יש להוסיף לבאר 300 מיקרוליטר מזון טרי ללא Ara-C מדי שבוע. אם התרבית נשמרת יותר מחודש, החלף מחצית מהמדיום במדיום הזנה טרי בכל שבוע מעבר לנקודת זמן של חודש (כאשר חצי המדיום הראשון הוחלף ב- DIV33). מבחינה מורפולוגית, הן נוירונים בעלי צפיפות גבוהה והן נוירונים בעלי צפיפות נמוכה נראים בריאים עד שלושה חודשים (הזמן הארוך ביותר שנצפה על ידי הנסיינים).