התמיינות תאי אב עצביים מושרים לאסטרוציטים

תקציר

מקור: Meyer, S., et al., Edenhofer, F. גזירה של פיברובלסטים אנושיים בוגרים והפיכתם הישירה לתאי אב עצביים הניתנים להרחבה. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את תהליך התמיינות תאי אב עצביים מושרים (iNPCs) לנוירונים ואסטרוציטים באמצעות מדיה מיוחדת.

פרוטוקול

1. הבחנה בין iNPCs

1. הבחנה לקראת שושלת עצבית
   1. תאי תרבית על לוחות מצופים למינין כמתואר לעיל. יש לשנות את המדיה לנוירו-דיפ-מדיה (DMEM/F-12, 1x N2, 1x B27, 300 נ"ג/מ"ל cAMP, 200 מיקרומטר ויטמין C, 10 נ"ג/מ"ל BDNF, 10 נ"ג/מ"ל GDNF) כאשר התאים נפגשים בכ-70%. החליפו מדיה כל יומיים במשך שלושה שבועות. אין לפצל תאים במהלך ההתמיינות.
   2. לאחר שלושה שבועות, תאים צריכים לבטא את הסמן העצבי TUJ1. כדי להשיג נוירונים בוגרים יותר ותת-סוגים עצביים, המשך התמיינות עד 3 חודשים.
2. הבחנה לקראת שושלת גליה
   1. שינוי מדיה לאינדוקציה גליה (1:1 DMEM/F-12: נוירובזל, 1x N2, 1x B27, 10 מיקרומטר β-מרקפטואתנול, 100 מיקרומטר חומצות אמינו לא חיוניות, 1.5 מילימטר L-גלוטמין, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 40 נ"ג/מ"ל T3) כולל 20 נ"ג/מ"ל EGF כדי לגרום להתמיינות לתאים מבשרי גלייה. הסר מחצית מהמדיה והחלף במדיה טרייה אחת ליומיים למשך כשבועיים. במהלך תקופה זו, תאים צריכים להיות מפוצלים 1: 3 בנוכחות 10 μM מעכב ROCK Y27632 כאשר 100% מפגש הוא הגיע.
   2. לאחר שבועיים, התמינו תאים עוד יותר לאסטרוציטים: כאשר התאים כמעט נפגשים, החליפו מדיה למדיה אסטרוציטית זמינה מסחרית, החליפו מדיה כל יומיים. לאחר כ-7 ימים, התאים מתחילים לבטא סמני אסטרוציטים (למשל, GFAP). אם התאים מקבלים 100% מפגש במהלך פרוטוקול ההתמיינות, לפצל אותם ביחס של 1:2 בנוכחות מעכב ROCK 10 מיקרומטר Y27632.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיה אסטרוציטית	ScienCell	1801
B27	לייף טכנולוגיות	17504-044
BDNF	פפרוטק	450-02
מחנה	סיגמא	A6885
DMEM	לייף טכנולוגיות	41966-029
DMEM F12	לייף טכנולוגיות	11320-033
DMSO	רוט	4720
DPBS	לייף טכנולוגיות	14190-094
EGF	לייף טכנולוגיות	PHG0313
FCS	Biochrom AG	50115
GDNF	פפרוטק	450-10
אינסולין	סרלאב	GEM-700-112-P
ל-גלוטמין	לייף טכנולוגיות	25030-024
למינין	סיגמא	L2020
N2	לייף טכנולוגיות	17502-048
נוירובזל	לייף טכנולוגיות	21103-049
חומצות אמינו לא חיוניות	לייף טכנולוגיות	11140-050
ויטמין C	סיגמא	A4544
β-מרקפטואתנול	לייף טכנולוגיות	21985023