1. שיקולים כלליים
- עיין בטבלת החומרים/ציוד לקבלת רשימה של ריאגנטים נחוצים. בצע את כל השלבים בתנאים אספטיים קפדניים.
- השתמש בסרום בקר עוברי מומת חום (hiFBS) עבור כל תכשירים מדיה הכוללים FBS. כדי להשבית חום, יש לחמם אליציטוט של 50 מ"ל של FBS בטמפרטורה של 56°C למשך 30 דקות, ולהפוך כל 10 דקות (ראו גם טבלה 1).
הערה: כאשר משתמשים ב-FBS ללא הפעלת חום, הפנוטיפ דמוי האפיתל מתקדם מהר יותר בתרביות של תאי SH-SY5Y.
- לפני השימוש, יש לאפשר למדיה להתחמם ולהתאזן באינקובטור כדי ליצור איזון pH תקין לפני כל צעד. לדוגמה, 50 מ"ל של מדיה לוקח בערך שעה כדי לאזן באופן מלא (pH 7, 37 ° C, 5% CO2).
הערה: פרוטוקול זה משתמש בהליך פיצול דו-שלבי הדורש טריפסיניזציה וציפוי מחדש של תאי SH-SY5Y ממוינים חלקית. זהו תהליך מלחיץ עבור תאים שבירים במיוחד אלה. לכן, חשוב לדגור על התאים בטריפסין למשך זמן מינימלי. זה יאפשר את ההרמה המועדפת של נוירונים, משאיר תאים דמויי אפיתל עדיין מחוברים לצלחת.
- בצע טריטורציה של תאים ממוינים לאט עם פיפטה פלסטיק 10 מ"ל עם קצה על החלק התחתון של הצינור החרוטי המכיל את התאים. בצע טריטורציה במהירות איטית, למעלה ולמטה לא יותר מחמש פעמים.
2. הפשרה ותרבית תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y לא ממוינים
- הכן מדיית צמיחה בסיסית.
- הפשיר במהירות תאים קפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס (כ -2 דקות).
- יש להשהות תאים במצע גידול בסיסי של 9 מ"ל בצינור חרוטי של 15 מ"ל, ולאחר מכן בצנטריפוגה למשך 2 דקות ב-1,000 x גרם.
- יש לשאוף את הסופרנאטנט תוך זהירות שלא להפריע לתאים הכדוריים, ולהשהות מחדש בעדינות תאים במצע גדילה בסיסי של 10 מ"ל.
- צלחת תאים על בקבוק T-25 או 60 מ"מ2 צלחת.
- למחרת, החלף מדיה כדי להסיר תאים מתים.
3. יום 0: ציפוי תאים להתמיינות
- ראו איור 1 ללוח הזמנים של הבידול.
- יש לשטוף תאים לא ממוינים עם 1x PBS, לשאוף, ולאחר מכן טריפסינזה באמצעות 1-2 מ"ל מחומם 1x 0.05% טריפסין-EDTA.
- כאשר התאים נמצאים בטריפסין, דוגרים במשך כ-3 דקות באינקובטור.
- להרוות את הטריפסין על ידי הוספת 10 מ"ל Basic Growth Media, לשטוף את הצדדים של בקבוק או צלחת, בעדינות triturate 1-3 פעמים. מעבירים את התוכן לצינור חרוטי בנפח 15 מ"ל.
- צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 1,000 x גרם ולשאוף את התקשורת תוך זהירות לא להפריע את הכדור.
- גלולה להשהות ב 5 מ"ל Basic Growth Media ו triturate 1-3 פעמים.
- ספרו תאים באמצעות המוציטומטר, ולאחר מכן דללו באמצעות Basic Growth Media ל-50,000 תאים/מ"ל.
- צלחת 2 מ"ל תאים לכל צלחת35 מ"מ 2 סה"כ 100,000 תאים לצלחת ומניחים בחזרה לאינקובטור.
4. יום 1: שינוי מדיה (מדיה בידול #1)
- Aliquot 50 מ"ל של מדיה בידול #1 (ראה טבלה 2) ולדגור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- כאשר המדיה מתחממת, יש לאפשר לה להתאזן באינקובטור (37°C, 5% CO2) למשך שעה אחת לפחות כדי לקבוע איזון pH תקין לפני השימוש.
- הוסף חומצה רטינואית (RA) (ראה טבלה 1) למדיה מחוממת ומאוזנת מיד לפני הוספת מדיה לכלים.
הערה: חומצה רטינואית רגישה לאור ויש לאחסן אותה בבקבוקים כהים בטמפרטורה של 4°C
- שאפו בעדינות מהמדיה הישנה והשליכו.
- מוסיפים 2 מ"ל מדיה בידול #1 עם RA לכל 35 מ"מ2 צלחת וחוזרים לאינקובטור.
5. יום 3: שינוי מדיה (מדיה בידול #1)
- חזור על סעיף 4 (שלבים 1-5)
6. יום 5: שינוי מדיה (מדיה בידול #1)
- חזור על סעיף 4 (שלבים 1-5)
7. יום 7: פיצול תאים 1:1
- הוסף RA למדיה בידול מחוממת ומאוזנת #1 מיד לפני הוספת מדיה לכלים.
- שאפו בעדינות מהמדיה הישנה והשליכו.
- יש להוסיף 200 μl מחומם 0.05% 1x טריפסין EDTA לכל 35 מ"מ 2 כלים ולחמם באינקובטור במשך כ 2-3 דקות או עד שהתאים מורמים באופן גלוי מהצלחת כפי שנצפה במיקרוסקופ.
- להרוות את טריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל Differentiation Media #1 עם RA לכל צלחת35 מ"מ 2 ולהשתמש במדיה כדי לשטוף את התאים העצביים הנותרים מהצלחת. לאחר מכן להעביר את התוכן 50 מ"ל צינור חרוט.
הערה: אין טריפסיניזציה של מנות רבות מדי בבת אחת במהלך שלבי הטריפסיניזציה. זה עוזר להבטיח תרביות עצביות אינם מודגרים טריפסין במשך זמן רב מדי, אשר יכול להיות ציטוטוקסי.
- ערבבו תוכן של עד 10 כלים בצינור חרוטי של 50 מ"ל וטריטו בעדינות באיטיות מעלה ומטה לא יותר מחמש פעמים עם פיפטה פלסטיק של 10 מ"ל.
- Aliquot 2 מ"ל תא השעיה לתוך טרי 35 מ"מ2 כלים ולחזור אינקובטור.
8. יום 8: שינוי מדיה (מדיה בידול #2)
- הוסף RA (ראה טבלה 1) למדיה מחוממת ומאוזנת מיד לפני הוספת מדיה לכלים.
- שאפו בעדינות מהמדיה הישנה והשליכו.
- הוסף לאט 2 מ"ל מדיה בידול #2 (ראה טבלה 2) עם RA לכל צלחת 2 מ"מ35 מ"מ וחזור לאינקובטור. אל תאפשרו לתאי עצב להיחשף לאוויר במשך תקופה ממושכת מכיוון שהם יכולים להתייבש במהירות.
9. יום 9: הכנת כלים מצופים מטריצה חוץ-תאית (ECM)
- הפשירו בקבוקון אחד של תמיסת ECM על קרח ודללו 1:100 ל-DMEM קר.
- מוציאים 2 מ"ל תערובת לתוך כל צלחת35 מ"מ 2 ומוודאים שכל בסיס המנה מכוסה.
- מניחים באינקובטור (37°C, 5% CO2) למשך שעה או לילה.
- יש לשאוף את התערובת ולאפשר לה להתייבש באוויר במשך כשעה במכסה המנוע. יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד חודשיים.
10. יום 10: העברת תאים ללוחות מצופים ECM 1:1
- הוסף RA (ראה טבלה 1) למדיה מחוממת ומאוזנת מיד לפני הוספת מדיה לכלים.
- שאפו בעדינות מהמדיה והשליכו.
- הוסף 200 μl טריפסין מחומם לכל צלחת35 מ"מ 2 ולאפשר לדגור בטמפרטורת החדר במשך כ 1-2 דקות או עד נוירונים מורמים מן הצלחת כפי שנצפה תחת מיקרוסקופ.
הערה: בצעו את שלב הטריפסיניזציה הזה בטמפרטורת החדר כדי למנוע דגירה מוגזמת של תאי עצב עם טריפסין וגרימת נזק. תאי עצב משתחררים מלוחות הרבה יותר מהר מאשר תאים דמויי אפיתל בשלב זה.
- להרוות את טריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל Differentiation Media #2 לכל צלחת35 מ"מ 2 ולהשתמש במדיה כדי לשטוף תאים עצביים שנותרו מהצלחת. לאחר מכן להעביר את התוכן לצינור חרוטי 50 מ"ל.
- ערבבו תוכן של עד 10 כלים בצינור חרוטי של 50 מ"ל וטריטו בעדינות באיטיות מעלה ומטה לא יותר מחמש פעמים עם פיפטה פלסטיק של 10 מ"ל.
- מוציאים תרחיף תאים של 2 מ"ל לתוך 2 צלחות 2 מצופה ECM ומחזירים לאינקובטור.
11. יום 11: שינוי מדיה (מדיה בידול #3)
- הוסף RA (ראה טבלה 1) למדיה מחוממת ומאוזנת מיד לפני הוספת מדיה לכלים.
- שאפו בעדינות מהמדיה הישנה והשליכו.
- מוסיפים לאט 2 מ"ל Differentiation Media #3 (ראה טבלה 2) עם RA לכל צלחת35 מ"מ 2 וחוזרים לאינקובטור. אל תאפשרו לתאי עצב להיחשף לאוויר למשך תקופה ממושכת.
12. יום 14: שינוי מדיה (מדיה בידול #3)
- חזור על סעיף 11 (שלבים 1-3)
13. יום 17: שינוי מדיה אחרון (מדיה בידול #3)
- חזור על סעיף 11 (שלבים 1-3)
14. יום 18: תרביות עצביות מוכנות לשימוש
- שנה מדיה למדיה חדשה בידול #3 עם RA כל 3 ימים כדי לשמור על בריאות הנוירון.
הערה: תאים צריכים להיות ממוינים לנוירונים ולהציג פנוטיפ עצבי. התרביות יציבות בדרך כלל עד 14 יום לאחר התמיינות סופנית. עם זאת, משך הכדאיות של נוירון תלוי במספר המעבר של התאים הבלתי ממוינים בתחילת ההתמיינות. מספרי מעבר גבוהים יותר מניבים תאי עצב ממוינים עם אורך חיים שימושי קצר יותר.
טבלה 1: פתרונות מלאי ורכיבים.
| רכיב | פרטים | מניות | הוראות |
| 10 μM RA | חומצה רטינואית All-trans | 5 mM | Resuspend 50 mg RA ב-33.3 מ"ל 95% EtOH. RA רגיש לחום, אור ואוויר. יש לאחסן בבקבוק כהה ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 6 שבועות. יש להשתמש בדילול 1:500 ולדלל לאמצעי בידול מיד לפני השימוש |
| (300.44 גרם/מול) |
| 1x B-27 | תוספת B-27 | פי 50 | יש להפשיר בקבוק 1-10 מ"ל ואת שארית aliquot לשימוש חד פעמי של 1 מ"ל ולאחסן בטמפרטורה של -80°C. לאחסן בקבוקים של 10 מ"ל בטמפרטורה של -20°C |
| 20 mM KCl | אשלגן כלורי | 1 M | מוסיפים 250 מ"ל מים ל-18.6 גרם KCl ולמסנן סטרילי. יש לאחסן בטמפרטורת החדר |
| (74.55 גרם/מול) |
| 2 mM db-cAMP | dibutyryl מחזורי AMP | 1 M | Resuspend בקבוק מלא על ידי הוספת 2.04 מ"ל מים ל-1 גרם db-cAMP. רגיש לאור וללחות. יש לאחסן באליציטוטים של 100 μl או 200 μl בטמפרטורה של -20°C או -80°C |
| (491.37 גרם/מול) |
| 50 נ"ג/מ"ל BDNF | גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF) | - | בקבוקון צנטריפוגה כדי לקבל אבקה לתחתית. השהה 10 מיקרוגרם בקבוקון ב 1 מ"ל נוירובזל + 1x B27 או 5 מיקרוגרם בקבוקון ב 0.5 מ"ל נוירובזל + 1x B27 כדי לקבל 10 מיקרוגרם / מ"ל. יש להשתמש בדילול של 1:200. אחסון אליציטוטים לעבודה בטמפרטורה של -80°C (לדוגמה: 250 μl) |
| hiFBS | סרום בקר עוברי מומת בחום | - | Aliquot הפשיר FBS לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל. יש לחמם ב-56°C באמבט מים למשך 30 דקות. הסר והקפיא aliquots עבודה ב -20 °C |
טבלה 2: מתכוני מדיה.
| מדיה לצמיחה בסיסית |
| רכיב | נפח ל-500 מ"ל | דילול |
| אנונימי | 415 מ"ל EMEM | |
| 15% hiFBS | 75 מ"ל hiFBS | |
| 1x עט/Strep | 5 מ"ל עט/Strep | 1:100 |
| 2 מ"מ גלוטמין | 5 מ"ל גלוטמין | 1:100 |
| *שמור למשך 6 שבועות לכל היותר | |
| Differentiation Media #1 |
| רכיב | נפח ל-50 מ"ל | דילול |
| אנונימי | 48 מ"ל EMEM | |
| 2.5% hiFBS | 1.3 מ"ל hiFBS | |
| 1x עט/Strep | 500 μl עט/Strep | 1:100 |
| 2 מ"מ גלוטמין | 500 μl גלוטמין | 1:100 |
| 10 מיקרומטר RA | 100 μl RA (מלאי 5mM) | 1:500 |
| *יש לשמור למשך שבועיים לכל היותר ולהוסיף RA מיד לפני השימוש |
| *אין לשמור מדיה נוספת לאחר הוספת RA - RA אינו יציב |
| Differentiation Media #2 |
| רכיב | נפח ל-50 מ"ל | דילול |
| אנונימי | 49 מ"ל EMEM | |
| 1% hiFBS | 500 μl hiFBS | |
| 1x עט/Strep | 500 μl עט/Strep | 1:100 |
| 2 מ"מ גלוטמין | 500 μl גלוטמין | 1:100 |
| 10 מיקרומטר RA | 100 μl RA (מלאי 5mM) | 1:500 |
| *יש לשמור למשך שבועיים לכל היותר ולהוסיף RA מיד לפני השימוש |
| *אין לשמור מדיה נוספת לאחר הוספת RA - RA אינו יציב |
| Differentiation Media #3 |
| רכיב | נפח ל-50 מ"ל | דילול |
| נוירובזל | 47 מ"ל נוירובזל | |
| 1x B-27 | 1 מ"ל B-27 (מלאי פי 50) | 1:50 |
| 20 מ"מ KCl | 1 מ"ל KCl (1M מלאי) | 1:50 |
| 1x עט/Strep | 500 μl עט/Strep | 1:100 |
| 2 mM GlutamaxI | 500 μl GlutamaxI (מלאי 100x) | 1:100 |
| 50 נ"ג/מ"ל BDNF | 250 μl BDNF (10 מיקרוגרם/מ"ל) | 1:200 |
| 2 mM dibutyryl מחזורי AMP (db-cAMP) | 100 μl db-cAMP (מלאי של 1M) | 1:500 |
| 10 מיקרומטר RA | 100 μl RA (מלאי של 5 מילימול) | 1:500 |
| *יש לשמור למשך שבועיים לכל היותר ולהוסיף RA מיד לפני השימוש |
| *אין לשמור מדיה נוספת לאחר הוספת RA - RA אינו יציב |
