$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. תרבית תאי גזע עובריים בעכבר
- הכינו צלחות או צלחות לתרבית תאים מצופות ג'לטין 0.1%.
- הוסף 2 מ"ל של 0.1% ג'לטין מעוקר (0.1% w/v במים) לכלים של תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ. נענעו בעדינות כדי להבטיח ציפוי אחיד של כלי תרבית התא.
- הכניסו את הכלים לאינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37°C ואפשרו ציפוי למשך שעה.
- הסר את תמיסת הג'לטין 0.1% לפני זריעת התאים.
הערה: לאחר הסרת הג'לטין, אין צורך לייבש או לשטוף את הכלים המצופה.
- תרבית תאי גזע עובריים של עכברים (A2lox ו-129)
- לדגור על תאי mESC (A2lox ו-129) בצלחות תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ מצופות ג'לטין בקוטר 0.1% במדיום גידול mESC בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של 5% CO2, בהתאמה. מדיום הגידול mESC מורכב מ-85% תערובת מדיום/מזין Anchor-Out של Dulbecco F-12 (DMEM/F12), 15% תחליף סרום נוק-אאוט (KSR), 0.1 מילימטר β-מרקפטואתנול (2ME), 2 מילימטר גלוטמקס, 1% חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 1000 U/mL גורם מעכב לוקמיה (LIF), 10 ננומטר CHIR-99021 (מעכב GSK-3) ו-0.33 ננומטר PD0325901 (מעכב MEK).
אזהרה: β-מרקפטואתנול הוא דליק ובעל רעילות בשאיפה. יש להרחיק ממקורות אש ולעטות מסכה כדי למנוע שאיפה בעת השימוש.
- שנה את מדיום הגידול mESC מדי יום לצמיחה טובה יותר של A2lox ו- 129.
- כאשר התאים מגיעים 80% מפגש, להסיר את המדיום ולהוסיף 1 מ"ל של 0.1% טריפסין לצלחת. נענעו בעדינות במשך 30 שניות כדי להבטיח כיסוי אחיד של טריפסין על כל התאים.
- השאירו את התאים למשך כדקה אחת כדי טריפסיניזציה ולאחר מכן הסירו את הטריפסין באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
- הוסף 2 מ"ל של מדיום גידול mESC לצלחת, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי ליצור תרחיף תא בודד.
- לספור את צפיפות התאים בהשעיה בצורה מדויקת ככל האפשר באמצעות המוציטומטר.
- חלקו את התאים ל-7 קבוצות וגרמו להתמיינות באמצעות פרוטוקולים שונים המוצגים בטבלה 1.
2. הבחנה בין mESCs ל- NPCs
- הכינו צלחות או כיסויים של תרביות תאים מצופות ג'לטין 0.1%.
- לפני השימוש, הכינו צלחות או כיסויים מצופים ג'לטין 0.1% כמו בשלב 1.1.
- בידול (טבלה 1)
- הוסף 1.5 x 106 mESCs לצלחת חיידקים לא דביקים ב 10 מ"ל של מדיום התמיינות בסיסי I כדי לאפשר היווצרות גוף עוברי ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2.
- לאחר יומיים, להעביר אגרגטים התא לתוך צינורות צנטריפוגות 15 מ"ל ולתת להם להתיישב על ידי כוח הכבידה.
- הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום התמיינות בסיסי טרי I כדי להשעות מחדש את הגוף העוברי. שתול אותם מחדש בכלי חיידקי חדש שאינו נדבק ואפשר התמיינות למשך יומיים נוספים.
- בדקו את היווצרות הגופות העובריות תחת המיקרוסקופ (איור 1A).
- לאסוף גופים עובריים כמתואר בשלבים 2.2.2-2.2.3. זרעו כ-50 גופים עובריים ב-2 מ"ל של מדיום התמיינות בסיסי I לכל באר על צלחות 6 בארות מצופות ג'לטין 0.1%.
- הכינו 1 mM All-Trans Retinoic Acid (RA) במלאי (ב-DMSO) ואחסנו הרחק מהאור במקפיא בטמפרטורה של -80°C לאחר אריזת המשנה.
הערה: RA אינו יציב, ויש לשים לב להרחיק אותו מאור ולהפחית את מגע האוויר במהלך הכנת מלאי RA.
- עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי לקבל ריכוז סופי של 1 μM.
- מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C ומבדיל במשך 4 ימים נוספים.
- שנה את כל 2 מ"ל של בינוני התמיינות בסיסית I (עם 1 μM RA) כל יומיים.
טבלה 1: פרטי הפרוטוקול המשמש להבחנה.
| פרוטוקול | מדיה |
| היווצרות גופים עובריים תוך 4 ימים + השראת RA בת 4 ימים | אמצעי התמיינות בזאלי:
DMEM/F12 +15% FBS + 1%NEAA+0.1mM 2ME+ 1%P/S |
