התמיינות של תאי אב עצביים לתאי עצב

תקציר

מקור: Mao, X., et al. התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים בעכבר במבחנה. J. Vis. Exp. (2020).

הסרטון הציג שיטה לתרבית תאים למיון תאי אב עצביים לנוירונים. על ידי דגירה של תאים בתווך עשיר בחומרים מזינים בתוספת גורמי גדילה, תאי האב התבגרו לנוירונים עם אקסונים ודנדריטים מפותחים. חומר מייצב הבטיח את קיום התא והגן מפני נזקי חמצון לאורך כל תהליך ההתמיינות.

פרוטוקול

1. הבחנה בין NPCs לנוירונים (שלב II)

1. זרעו כ-5 x 10⁵ תאי גזע עובריים של עכברים או נגזרות mESC בתוך 2 מ"ל של מדיום התמיינות בסיסי I לכל באר על צלחות 6 בארות מצופות ג'לטין 0.1%. חלקו באופן אקראי את נגזרות mESC ל-3 קבוצות, כפרוטוקול שלב II 1, פרוטוקול 2 ופרוטוקול 3, בהתאמה.
2. הניחו את הצלחת באינקובטור 5% CO₂ בטמפרטורה של 37°C כדי לאפשר חיבור למשך 6 שעות. שטפו אותם פעמיים עם 2 מ"ל PBS.
3. הוסף 2 מ"ל של מדיום התמיינות בסיסי I, N2B27 בינוני I ו- N2B27 בינוני II (טבלה 1), בהתאמה, לכל באר מהקבוצות לעיל.
4. מניחים את הצלחות לתוך האינקובטור ומאפשרים להם להבדיל עוד 10 ימים. שנה את המדיום המתאים כל יומיים.
5. בדוק את מצב ההבחנה ורשום את השינויים המורפולוגיים כפי שהוזכר בשלב 3.
6. ביום ה -18, להעריך את הדור של נוירונים (β-Tubulin III חיובי) ולקבוע את יעילות ההבחנה של 3 פרוטוקולים המשמשים בשלב 4.

תוצאות

טבלה 1: פירוט 3 הפרוטוקולים המשמשים בהבחנה שלב II.

Differentiation Phase II (10d)
	פרוטוקולים	מדיה
פרוטוקול 1	דיפרנציאציה באופן טבעי: עם מדיום התמיינות בסיסי אני בלבד	אמצעי התמיינות בסיסי I: DMEM / F12 + 15% FBS +1% NEAA +0.1m...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדן אנטי-β-טובולין III המיוצר בארנב	סיגמא אולדריץ'	T2200	יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C, להימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות
תוסף B-27 (50X), ללא סרום	גיבקו	17504044	מאוחסן בטמפרטורה של -20°C, ומגן מפני אור
DME/F-12 1:1 (1x)	הייקלון	SH30023.01B	מאוחסן ב-4°C
סרום בקר עוברי	הייקלון	SH30084.03	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C, להימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	אולימפוס	CKX53
ג'לטין	גיבקו	CM0635B	מאוחסן בטמפרטורת החדר
תוסף GlutaMAX	גיבקו	35050061	מאוחסן ב-4°C
צביעה חיסונית מאגר דילול נוגדנים ראשוני	ביוטיים	P0103	מאוחסן ב-4°C
נוקאאוט DMEM/F-12	גיבקו	12660012	מאוחסן ב-4°C
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות	גיבקו	11140076	מאוחסן ב-4°C
תוסף N-2 (100X)	גיבקו	17502048	מאוחסן בטמפרטורה של -20°C ומגן מפני אור
סרום עיזים רגיל	ג'קסון	005-000-121	מאוחסן ב -20 °C
מדיום נוירובזלי	גיבקו	21103049	מאוחסן ב-4°C
צלחת חיידקית לא דבקה	קורנינג	3262
מלח חוצץ פוספט (1X)	הייקלון	SH30256.01B	מאוחסן ב-4°C
תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין	הייקלון	SV30010	מאוחסן ב-4°C
PD0325901(Mirdametinib)	סלק	S1036	מאוחסן ב -20 °C
חומצה רטינואית	סיגמא	₪625	מאוחסן בטמפרטורה של -80°C ומגן מפני אור
זן 129 תאי גזע עובריים של עכבר	סיאגן	MUAES-01001	מתוחזק במערכת תרבית ללא מזין
2-מרקפטואתנול	גיבקו	21985023	מאוחסן ב-4°C ומגן מפני אור
4% פרפורמאלדהיד	ביוטיים	P0098	מאוחסן ב -20 °C
6 - צלחת באר	קורנינג	3516
צלחת תרבית תאים 60 מ"מ	קורנינג	430166
15 מ"ל צינור צנטריפוגה	NUNC	339650