בידוד תאים מגרעינים חושיים

תקציר

מקור: Kaelberer, M. M., et al. שיטה למיקוד ולבידוד נוירונים חושיים עצבניים בדרכי הנשימה בעכברים. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים את בידוד התאים מגרעיני החישה של עכברים. גרעינים נתונים לעיכול אנזימטי כדי להמיס את המטריצה החוץ תאית. תאים בודדים נאספים לאחר מכן באמצעות סינון דרך מסננת תאים ואחריה צנטריפוגה הדרגתית צפיפות לפינוי פסולת. לבסוף, שטיפה וצנטריפוגה נעשות כדי לאסוף את התאים המבודדים לניתוח עתידי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. דיסוציאציה של גרעינים חושיים

1. פיפטה החוצה 500 μl Ganglia Dissociation Solution (GaDS) (טבלה 1), ומשאירה גרעינים בצינור. שטפו את הגרעינים פעם אחת על ידי הוספת 1 מ"ל תמיסת חיץ פוספט (PBS), המתינו עד שהגרעינים ישקעו לתחתית הצינור, ואז הפיפט החוצה PBS.
2. יש להוסיף 1 מ"ל GaDS ו-22 מיקרוליטר אנזימי עיכול (collagenase I/II ותערובת פרוטאז, 2.5 מ"ג/מ"ל במים) לכל צינור.
3. הוסף 20 μl כחול מהיר (5.26 mM) לצינור הבקרה החיובי.
4. שים את הצינורות באמבט מים או בלוק חימום להגדיר ב 37 ° C.
5. כל 15 דקות, נערו את הצינורות לזמן קצר והעבירו אותם כדי לוודא שהגרעינים מכוסים בתמיסה.
   הערה: זמן עיכול הגרעינים תלוי בגיל אנזים העיכול. בתוך חודש של המסת אנזים העיכול, לעכל במשך 30 דקות; בתוך 2-6 חודשים, לעכל במשך 45 דקות. אם האנזים בן יותר משישה חודשים, עיכול הגרעינים במשך 60 דקות.
6. בזמן שהגרעינים מתעכלים, הכינו שיפועי צפיפות באמצעות תמיסת חלקיקים (חלקיקי סיליקה קולואידים המצופים בפוליוויניל פירולידון).
7. ערבבו 12% תמיסת חלקיקים ב-GaDS, 500 μl לדגימה.
8. ערבבו 28% תמיסת חלקיקים ב-GaDS, 500 מיקרוליטר לדגימה.
9. הוסף לאט ובזהירות תמיסת צפיפות של 400 μl 12% על גבי תמיסת צפיפות של 400 μl 28% בצינור טרי של 1.5 מ"ל לכל דגימה. אין לאפשר לשתי השכבות להתערבב. שתי שכבות נפרדות צריכות להיות גלויות בצינור, אחת כהה יותר מהשנייה.
10. לאחר זמן העיכול המתאים, להסיר GaDS עם אנזים העיכול ולשטוף גרעינים פעמיים עם 1 מ"ל PBS. הוסף 200 μl של GaDS טרי לכל צינור.
11. השתמש פיפטה 200 μl, מוגדר לנפח 100 μl, ואת גרעיני פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפרק תאים בנפרד. חזור על הפעולה עד שלא נראית פיסת רקמה שלמה. הימנעו מיצירת בועות בתמיסה.
12. מעבירים תאים מנותקים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר.
13. הוסף עוד 100 μl GaDS לצינור הדיסוציאציה המקורי כדי לאסוף את כל התאים התועים שנותרו ולהעביר את התמיסה הנוספת דרך מסננת התא. בעזרת קצה פיפטה חדש, אספו את שאריות הנוזל המכיל תאים שעבר דרך המסננת ונצמד לרשת. הנפח הסופי של תאים המרחפים ב- GaDS הוא 300 μl.
14. שכב בזהירות את 300 μl של תאים על גבי שיפוע צפיפות שנוצר בעבר. הימנעו מבועות וערבוב תאים עם שכבות הצפיפות.
15. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-2,900 x גרם ב-RT.
16. לאחר השלמת הצנטריפוגה, הסר בזהירות והשלך את שכבת 700 μl העליונה. שכבה זו מכילה את רוב פסולת התאים שאחרת תפריע למיון התאים.
17. הוסף 700 μl GaDS טרי לתא הנותר המכיל תמיסה ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב.
18. 18. צנטריפוגה למשך 15 דקות במהירות של 2,900 x גרם לתאי כדור.
19. 19. לאחר ביצוע הצנטריפוגה, בזהירות להסיר ולהשליך את supernatant, משאיר את גלולת התא.
20. השהה מחדש את גלולת התא ב 200 - 300 μl GaDS על ידי pipeting למעלה ולמטה עם פיפטה 1,000 μl להגדיר 200 μl מספר פעמים. שים דוגמאות על קרח.

טבלה 1. תערובת מגיבים לתמיסת דיסוציאציה גנגליה (GaDS).

מרכיב	כמות
DMEM/f12 מתקדם	9.5 מ"ל
גלוטמין	100 מיקרוליטר
HEPES (10 מ"מ)	100 מיקרוליטר
תוספת N2	100 מיקרוליטר
B27 (ללא ויטמין A)	200 מיקרוליטר
NGF (50 מיקרוגרם/מ"ל)	10 מיקרוליטר

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פוספט חוצץ מלוחים חוצצים (PBS) של Dulbecco Ca ו Mg חינם	גיבקו	14190-144
DMEM/F12 מתקדם	גיבקו	12634-010
גלוטמין (גלוטמקס)	גיבקו	35050-061
HEPES	גיבקו	15630-080
N2	גיבקו	17502-048
B27 (ללא ויטמין A)	גיבקו	12587-010
גורם גדילה עצבי (NGF)	סיגמא	N6009	מלאי 50 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS/10% FBS
אנזים עיכול, Liberase DH ציון מחקר	רוש	5401054001	מלאי 2.5 מ"ג/מ"ל במים
תמיסת חלקיקים (Percoll)	סיגמא	P1644-25ML
בלוק חימום	LabNet
מסננת תאי 70 אום	בז	352350