כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
NOTE: הפרוטוקול שלהלן מתאר את שיטת ההכנה והתרבית לדגירת טווח והדמיה לסירוגין של פרוסות היפוקמפוס. פרוסת היפוקמפוס בודדת מחוברת לכיסוי פוטו שהוכן במיוחד באמצעות קריש פלזמה, ולאחר מכן הכיסויים נאטמים על הצד השטוח של צינור רולר קדוח, אשר נשמר באינקובטור גלילים.
1. הכנת מתלה צינור רולר
- השתמשו בתבנית המוצגת באיור 1A המודפסת בגודל המוצג בסרגל קנה המידה. בעזרת מסמר, נקבו חורים קטנים (גדולים מספיק לסמן נקודתי עדין) בתבנית שמרכזה בחורים.
- מניחים את התבנית בתחתית צלחת תרבית רקמה בקוטר 15 ס"מ (קוטר נומינלי של 14 ס"מ) ומסמנים את מיקום החורים. חזור על כך במנה שנייה.
- בעזרת מקדחים המיועדים לשימוש על פלסטיק, קודחים שישה חורים בקוטר 1.5 ס"מ על כל צלחת במערך משושים (4.8 ס"מ ממרכז למרכז) עם מרכזי חורים 2.5 ס"מ מקצה המנה. קדח שלושה חורים (בקוטר 3 מ"מ) במרחק 12 מ"מ מהקצה הממוקמים במרחק שווה בין שניים מהחורים הגדולים יותר כפי שמוצג באיור 1A.
- כאשר תחתית כל צלחת פונה זו לזו, הניחו בורג מכונה באורך 2.5 אינץ' (קוטר 3/16 אינץ') עם מכונת כביסה שטוחה דרך אחד החורים הקטנים ואחריו מכונת כביסה שטוחה שנייה, חתיכת צינור פוליאתילן (ספייסר, 4.7 ס"מ), מכונת כביסה שטוחה נוספת, צלחת תרבית רקמות שנייה, מכונת כביסה שטוחה נוספת, מכונת כביסה ננעלת, ואגוז.
- חזור על שלב 1.4 בשני ברגי המכונה האחרים והדק רק באופן רופף עד שכל ברגי המכונה יהיו במקומם. לאחר מכן הדקו את האגוזים היטב.
- הכניסו את הגרומט (בעובי 5/16 אינץ', בקוטר חור של 5/8 אינץ') לתוך החורים של הצלחת התחתונה כדי לקבל את מתלה צינורות הגלילה הסופי (איור 1B; מוצג עם שני צינורות במקומם). הדביקו מדבקה על כל מדף עם מספר ייחודי.
2. הכנת צינורות רולר וכיסויים
- ביצוע הג'יג לקידוח החור בצינורות רולר
- קדח חור בעומק 1.5 ס"מ בעומק 8 ס"מ בצד המרכזי של בלוק עץ בגודל 2 x 4 x 5.5 אינץ' בזווית כך שהצד השטוח של צינור הגלילה יהיה כמעט מקביל לבלוק בעת הכנסתו (איור 2A).
- הגדילו את החור באמצעות קובץ עץ עגול כדי להרחיב ולחדד את החור כדי לאפשר החדרת צינור (צינורות רולר בקוטר מעט גדול יותר ליד קצה המכסה) (איור 2B).
- קדח חור אנכי בקוטר 1.5 ס"מ, 5.5 ס"מ מהצד של הבלוק, ובמרכזו חור הצד (איור 2C).
- כאשר החור הצדדי מחודד מספיק, מכניסים צינור רולר המסומן בנקודה הרצויה כדי למרכז את החור עבור הפרוסה ולמקם את הצינור כך שהנקודה המסומנת תהיה ממורכזת בחור אנכי של 1.5 ס"מ.
- הסר את הצינור ומדד את המרחק מהנקודה לקצה הצינור. סמנו את המרחק הזה ממרכז החור בג'יג והכניסו מסמר כדי לספק עצירה למיקום נכון של הצינור לקידוח (חץ באיור 2C).
- השתמש במסור כדי לחתוך את המסמר עם פני השטח של גוש העץ כדי למנוע פציעה.
- הוסיפו תפסי קפיץ בתחתית הג'יג אם יש מקדחה עם חריצים שמאפשרים לעגן אותה (איור 2D חץ שחור). אחרת, השתמש במהדקי C כדי להחזיק את הג'יג בבטחה על המקדחה.
- בעזרת הג'יג שתואר לעיל כדי להחזיק ולמקם צינור תרבית פלסטיק שטוח בקוטר 11 ס"מ עם הצד השטוח למעלה (איור 2A), קדח חור בקוטר 6 מ"מ כאשר המרכז 1.0 ס"מ מלמטה וממורכז בין צידי הצינור.
הערה: יש להשתמש במקדחה המיועדת לפלסטיק.
- בעזרת כלי סיבוב, החליקו את קצוות החור (איור 2E) וצרו 4 חריצים בקצה הפנימי של החור (איור 2E, כניסה) כדי להקל על ניקוז החור במהלך הסיבוב.
- עם ניקוב חורים בקוטר 12 מ"מ, חתכו דיסקים בקוטר 12 מ"מ מיריעות גומי סיליקון דו-צדדיות לא רעילות. באמצעות ניקוב נייר סטנדרטי של חור אחד (קוטר 6 מ"מ), צור חור במרכז כל דיסק.
- יש לשטוף את הצינורות הקדוחים באתנול 70%, לייבש אותם באוויר בארון בטיחות ביולוגי ולעקר את הצינורות ואת דיסקיות ההדבקה המנוקבות למשך 40 דקות מתחת למנורת האולטרה סגול (UV) (30 ואט במרחק ממוצע של 70 ס"מ) בארון הבטיחות הביולוגי.
- מקם מחדש את הצינורות והדיסקים לאחר 20 דקות כך שכל המשטחים החשופים יעוקרו. בתנאים סטריליים, קלפו את הגב הלבן מדיסק הדבקה והצמידו את גומי הסיליקון לחלק החיצוני של הצינור, תוך יישור החורים (איור 2F).
זהירות: כדי להימנע מחשיפה לקרינת UV, יש ללבוש מגן עיניים ולסגור את הארון לפני הפעלת מנורת ה-UV.
- נקי בקוטר 12 מ"מ פוטו חרוט (100 מרכז ממוספר 1 מ"מ ריבועים) זכוכית גרמנית מכסה. החזיקו את הכיסויים בעדינות עם מלקחיים וטבלו באתנול מוחלט, לאחר מכן מים, אחריהם שוב אתנול מוחלט, ולבסוף טבלו את הכיסויים בלהבה כדי לשרוף את האתנול. הניחו לכיסויים להתקרר.
- מחזיקים את הכיסויים עם מלקחיים, לטבול לתוך 2% 3-aminopropyltriethoxysilane באצטון במשך 10 שניות. לשטוף את הכיסויים עם מים טהורים במיוחד ולאפשר להתייבש באוויר.
- הניחו את הכיסויים על נייר סינון סטרילי בתוך ארון בטיחות ביולוגי והדליקו את אור ה-UV. יש לחשוף כל צד של הכיסויים למשך 20 דקות.
זהירות: כדי להימנע מחשיפה לקרינת UV, יש ללבוש מגן עיניים ולסגור את הארון לפני הפעלת מנורת ה-UV.
3. הכנת פרוסת היפוקמפוס
- לפני תחילת הדיסקציה, הכינו חצאים של סכיני גילוח פיפיות למסוק הרקמות. קפלו את הלהבים לאורכם בזהירות עם האצבעות והצמידו לשניים.
- שטפו את חצאי הלהב באצטון באמצעות צמר גפן כדי לנקות אותם, ולאחר מכן שטפו באתנול מוחלט וייבוש באוויר. לפני הרכבת חצי להב על מסוק הרקמות, לעקר אותו על ידי שטיפה עם 70% אתנול.
- פעל בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים; לאחר הרדמה איזופלורנית, יש להרדים עכבר או גור חולדות בן 4-7 ימים על ידי עריפת ראשו ולהסיר את ראשו עם מספריים או גיליוטינה.
הערה: פרוטוקול תרבית פרוסות המוח אינו תלוי בזן או גנוטיפ של עכבר או חולדה. נעשה שימוש בקווי עכברים טרנסגניים רבים עם רקע גנטי שונה.
- שטפו את הראש באתנול 70%, והניחו אותו בכלי פטרי בקוטר 60 מ"מ. עד להרכבה הסופית של פרוסת המוח על צינור הרולר, כל השלבים הבאים מבוצעים במכסה מנוע זרימה למינרית כדי לשמור על סטריליות.
- באמצעות להב כירורגי #21, לבצע חתך sagittal דרך העור והגולגולת. עם מלקחיים #5 Dumont, לקלף בחזרה את העור ואת הגולגולת כדי לחשוף את המוח.
- עם מלקחיים סגורים, להקניט בעדינות את המוח כולו, לשחרר אותו על ידי צביטה עם מלקחיים דרך גזע המוח מאחורי המוח הקטן. הכניסו את המוח לצלחת סטרילית בקוטר 60 מ"מ המכילה תמיסת מלח מאוזנת של גיי בטמפרטורה של 4°C/0.5% גלוקוז (GBSS/גלוקוז).
- באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה כדי להמחיש את המוח (איור 3A), מקמו את הצד הגבי של המוח כלפי מעלה וחתכו את השליש הקדמי של המוח ואת המוח הקטן באמצעות להב כירורגי (איור 3B).
- בעזרת מלקחיים, החזיקו את הצד האחורי של המוח החתוך כלפי מעלה ואת הצד הגחוני כנגד הצד של צלחת הפטרי ליציבות. הרחיקו בעדינות את קרומי המוח סביב קו האמצע של הקשת והוציאו את רקמת המוח האמצעית באמצעות מלקחיים דקיקים מסוג Dumont #5 (איור 3C, עיגול מקווקו).
- בצעו שני חתכים לאורך הצד של המוח כדי לפזר אותו פתוח (איור 3C, קווים מקווקוים). ברגע שהמוח ממוקם בצד הגבי כלפי מטה ומתפשט פתוח, הסדק בהיפוקמפוס אמור להיות גלוי (איור 3D, חץ).
- מעבירים את המוח הפתוח לחתיכה של סרט פלסטיק פוליכלורוטריפלואוראתילן וממקמים אותו לחיתוך על הבמה של מסוק רקמות. הרטיבו את הלהב עם GBSS/גלוקוז וחתכו את ההיפוקמפוס לפרוסות בעובי ~300 מיקרומטר.
- בעזרת פיפטת העברה, שטפו את המוח החתוך מסרט הפלסטיק לצלחת טרייה בקוטר 60 מ"מ שמכילה GBSS/גלוקוז (איור 3E). צבטו והקניטו בעדינות, בעזרת מלקחיים עדינים, את קרומי המוח שנותרו ורקמות אחרות שאינן בהיפוקמפוס (איור 3F) מהפרוסות (איור 3G, H).
4. ציפוי פרוסות
- לאחר קבלת הפרוסות, הניחו 2 μL של פלזמה עוף במרכז הצד המצולם של כיסוי מוכן. מפזרים מעט את הפלזמה כדי להשיג נקודה בקוטר 3-4 מ"מ.
הערה: הצד החרוט הוא הצד העליון של הכיסוי כאשר מסתכלים דרך מיקרוסקופ דיסקציה כך שהמספרים מכוונים נכון.
- העבירו פרוסת מוח אחת בעזרת מרית סטרילית בעלת קצה צר (איור 4A) לנקודת הפלזמה (איור 4B). השתמשו במלקחיים סגורים כדי לשמור את הפרוסה על קצה המרית בזמן שאתם מרימים את הפרוסה מה-GBSS/גלוקוז.
- געו במרית לנקודת הפלזמה שעל הכיסוי, ובעזרת מלקחיים סגורים דחפו את הפרוסה אל הכיסוי.
- מערבבים 2.5 μL של פלזמה עם 2.5 μL של טרומבין בצינור נפרד. הניחו במהירות 2.5 מיקרוליטר של התערובת הזו מעל ומסביב לפרוסה ומזלפים למעלה ולמטה בעדינות כדי לערבב אותה (איור 4B).
הערה: הפלזמה תהיה קריש בתוך 10-15 שניות, ולכן זה חייב להיעשות במהירות. אם יש בעיה בהידבקות של פרוסה, יש לערבב פלזמה של 5 μL עם תרומבין של 5 μL ולהשתמש ב-4-5 μL על הפרוסה, להסיר מעט לאחר הערבוב כך שהפרוסה תשכב שטוחה על הכיסוי.
- הסירו את כיסוי הפלסטיק השקוף מהצד החשוף של דבק גומי הסיליקון שהודבק קודם לכן לצינור רולר והניחו את הכיסוי עם פרוסת המוח על הדבק שמיישר את הפרוסה בתוך החור (איור 4C).
- כדי להבטיח הדבקה, הפעילו לחץ רך ואחיד על הכיסוי עם האגודל על ידי לחיצה אחידה על הכיסוי כלפי מטה והחזקתו למשך כדקה תוך העברתו לארון הבטיחות הביולוגי.
- בארון בטיחות ביולוגי, הוסיפו 0.8 מ"ל של תרבית נוירובזלית A מלאה (טבלה של חומרים) לכל צינור (איור 4D).
- הזרימו תערובת אוויר של 5% CO2/95% דרך פיפטת פסטר סטרילית מחוברת כותנה המוחזקת היטב על ידי מהדק. שוטפים את צינור הרולר בתערובת הגז ומכסים במהירות את הצינור כשהוא נסוג מרחבי הפיפטה.
- תייגו את הצינורות עם מספר הפרוסה ומספר המדף. הכנס צינורות למדף גלילים, וודא שהם מאוזנים מבחינה גיאומטרית. אם יש מספר אי-זוגי של צינורות, הוסף צינורות לאיזון.
- הניחו את המדפים באינקובטור גלילים של 35°C עם גלילים שמסובבים את מדף הגלילים במהירות של 10-13 סיבובים לשעה (RPH) (איור 4E). כדי לשמור על התווך בתחתית הצינורות, הטה את האינקובטור לאחור כ-5° על ידי הגבהת חזיתו על לוח.
