ייזום הרחבה והיווצרות מהירה של תאי עצב קשרים עצביים פונקציונליים

תקציר

מקור: M. H. Magdesian et al., Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurit Extension and Functional Neuronal Connection, J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים טכניקה לאתחול והרחבה מהירים של תא עצב ויצירת קשרים חדשים עם נוירון מטרה באמצעות מכשיר מיקרופלואידי ומיקרומניפולציה. זה יכול לשמש לטיפולים שמטרתם לחבר מחדש מעגלים עצביים לאחר טראומה או במחלות נוירודגנרטיביות.

פרוטוקול

1. סטנדרטיזציה של תרביות עצביות באמצעות התקנים מיקרופלואידים: הרכבת מכשירים

1. בחר מכשיר מיקרופלואידי מתאים לניסוי הרצוי. כדי לחבר תאי עצב באותה אוכלוסייה, השתמשו בהתקני נוירו (איור 1), וכדי לחבר תאי עצב באוכלוסיות שונות, השתמשו בהתקני התרבית המשותפת (איור 2).
2. נקו והכינו את המספר הרצוי של כיסויים סטריליים או כלים תחתונים מזכוכית. לקבלת התוצאות הטובות ביותר על משטחי פלסטיק, יש להשתמש בכלים בקוטר 35 מ"מ, בזכוכית יש להשתמש בכיסויים בקוטר 25 מ"מ או בכלים תחתונים מזכוכית בקוטר 35 מ"מ. בחר עובי זכוכית על סמך מערכת ההדמיה, למשל, 0.15 מ"מ.
3. מצפים את הכלים או הכיסויים ב-0.5-1 מ"ל של 100 מיקרוגרם/מ"ל PDL למשך שעתיים או לילה בטמפרטורת החדר.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולחדש אותו למחרת אם רוצים. בנוסף, ניתן לצפות את הכלים ב-PDL מדולל חוצץ, פולי-ל-ליזין (PLL), למינין או כל מולקולת היצמדות תאים אחרת.
4. שטפו את הכלים פעמיים במים (אל תשתמשו במי מלח חוצצי פוספט (PBS) מכיוון שגבישי מלח עלולים לחסום את התעלות), הסירו את כל הנוזלים והניחו להם להתייבש בסביבה סטרילית כגון ארון בטיחות ביולוגית למשך 5-10 דקות או עד שהמשטח יבש לחלוטין.
   הערה: היזהר לוודא כי הכיסויים יבשים לחלוטין, שכן כל נוזל שנותר יפריע להידבקות של מערכות microfluidic.
5. מקם התקנים מיקרופלואידים עם תבניות הפונות כלפי מעלה תחת אור UV בסביבה סטרילית (ארון בטיחות ביולוגית) למשך 10 דקות. הקפד לעקוב אחר נהלים סטריליים בעת עבודה בארון הבטיחות הביולוגית10.
6. בעזרת פינצטה, הניחו מכשיר מיקרופלואידי עם תבנית הפונה כלפי מטה במגע עם הכיסוי/צלחת הנקיים. השתמש בפינצטה כדי ללחוץ ברכות על המכשיר כך שייצמד לזכוכית.
   הערה: השקיפות של האזור המודבק תיראה כאשר מסתכלים על האור. ודאו שכל הפינות במגע עם הזכוכית. עשה זאת לכל המכשירים המיקרופלואידים. ראו איור 1א.
7. כדי למלא את מכשיר האוכלוסייה הבודדת בתווך, כוונו את הפיפטה לכיוון התעלות והוסיפו 50 מיקרוליטר של תווך תאים שלם בתוספת B-27 ללא סרום (יחס נפח 1:50) ו-500 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין/גלוטמין (הנקראים ביחד NBM) לבאר העליונה הימנית, ולאחר מכן הוסיפו עוד 50 מיקרוליטר לבאר השוכבת באלכסון אליה. עשו זאת עבור כל המכשירים, וודאו שהתווך זורם בין בארות. לאחר מכן, להוסיף 50 μL של בינוני לשתי הבארות הנותרות. ראו איור 3א.
   1. כדי למלא את מכשיר ריבוי האוכלוסין בתווך, כוונו את הפיפטה לכיוון התעלות והוסיפו 30 מיקרוליטר של NBM שלם לבארות הימניות, עיינו באיור 2a. עשו זאת עבור כל המכשירים, וודאו שהתווך זורם בין בארות. לאחר מכן, להוסיף 50 μL של בינוני לארבע הבארות הנותרות.
8. מניחים את המכשירים בצלחת גדולה יותר עם צלחת פתוחה עם מים אוטוקלאביים (תא רטוב) ומניחים באינקובטור (37°C, 5% CO₂ ו-95% לחות) למשך 1-2 שעות בזמן הכנת תרבית התא. ראו איור 3b.

2. ציפוי נוירונים במערכות מיקרופלואידיות

1. בהתאם לפרוטוקול, השיגו נוירונים מנותקים בהיפוקמפוס או בקליפת המוח מעוברי חולדות Sprague Dawley (משני המינים).
2. השעיה מחדש של תאי עצב עובריים ב-NBM בריכוז של 1-2 מיליון נוירונים/מ"ל. יש לוודא את ריכוזי התאים במיקרוסקופ באמצעות המוציטומטר ולעקוב אחר סימוכין8. התאם את ריכוז התא בהתאם לצפיפות התא הרצויה. כדי להגדיל את הסיכויים לקבל אקסונים היפוקמפוסיים בודדים בכל ערוץ, צלחת 10,000 נוירונים לכל מכשיר. כדי שיהיו אקסונים מרובים באותו ערוץ, לוחית 60,000 נוירונים לכל מכשיר.
   הערה: מספרים אלה משתנים בהתאם לסוג העצבי המשמש.
3. הסר את המדיום מהמכשירים המיקרופלואידים מבלי לרוקן את הבארות. השאירו כ-5 μL בכל אחד.
4. כדי ללוות תאים במכשיר אוכלוסייה יחידה, הוסף 50 μL של NBM לבאר הימנית התחתונה. בשלב זה, התווך זורם מעצמו כדי למלא את הבאר התחתונה השנייה. הוסף 20 μL של תמיסת תאי התרכיז לבאר הימנית העליונה של ההתקן המיקרופלואידי, כפי שמצוין באיור 1b.
   1. כדי ללוות תאים במכשיר של ריבוי אוכלוסיות, הוסיפו 20 מיקרוליטר של תמיסת תאי התרכיז לכל אחת מהבארות הנכונות באיור 2a.
5. בדוק במיקרוסקופ אם תאים נמצאים בתוך התאים ומקם את המכשירים באינקובטור למשך 15-30 דקות כדי לקדם את חיבור התאים למצע.
6. בדוק במיקרוסקופ אם יש מספיק תאים בתאים. אם יש צורך בשלבים נוספים, חזור על שלבים 2.4 ו- 2.5.
7. הוסף 50 μL של NBM ל-2 הבארות העליונות של התקן האוכלוסייה הבודדת ו-20 μL של NBM לאותה באר שבה התאים הוזרקו במכשיר ריבוי האוכלוסיות. התקשורת בולטת מעט ויוצרת מניסקוס חיובי המעניק לבארות היבט עליון של מאפינס. שוב, ראו איור 3a.
8. שמרו על התאים בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ ו-95% לחות.

3. שמירה על התרביות העצביות

1. הסר NBM (בערך 30 μL עם פיפטה) מהתאים והחל NBM חדש שחומם מראש ביום שלאחר הכנסתם להתקנים (כלומר 1 d לאחר שלב 2).
2. בדוק כל יומיים אם יש מספיק מדיום בכל ערוץ. אם החלק העליון של המאפין נמוך, פשוט הוסיפו עוד מדיום לבארות העליונות.
3. תאי תרבית לפחות 7 d לפני הסרת המכשירים המיקרופלואידים. התאים יכולים לשרוד במכשירים אלה במשך מספר שבועות. הסר את המכשירים 1-2 ימים לפני ביצוע ניסויים על דגימות.

4. הסרת התקנים מיקרופלואידים

1. 1 - 2 d לפני הסרת התקנים microfluidic, להוסיף 2 מ"ל של NBM מחומם מראש ל 37 ° C לכל צלחת דגימה, מציף את החדרים, ולתחזק את המכשירים באינקובטור.
2. השתמש בפינצטה סטרילית וקצה אחד כדי להסיר את המכשירים המיקרופלואידים מהכיסויים ולהשאיר תצורה מעוצבת של נוירונים. השתמש בקצה כדי להחזיק את הכיסוי במקומו ובפינצטה כדי לאחוז את קצה המכשיר בפינה השמאלית התחתונה של הבאר. יש למרוח פיתול בעדינות, להרים את המכשיר עם הפינצטה כך שהוא מקלף את הכיסוי. ראו איור 3c-3d.
3. כל 2-3 ימים, להחליף חצי NBM עד הדגימה משמש לניסויים.
4. לפני ביצוע ניסויי חיווט מחדש על הדגימה, יש לוודא כי תאי עצב בתעלות התקן האוכלוסייה הבודדת ואוכלוסיות נוירונים במכשיר ריבוי אוכלוסיות מבודדים על ידי בחינת המרווחים ביניהם במיקרוסקופ כדי לוודא שאין חוטים המקשרים בין אוכלוסיות נוירונים.

5. הכנת חרוזים מצופים PDL

1. הוסף 2 x 50 μL טיפות של 4, 10 או 20 מיקרומטר חרוזי פוליסטירן מדוללים במים (1:500) ל 1 מ"ל של PDL (100 מיקרוגרם / מ"ל). להשאיר לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולחדש אותו למחרת.
2. צנטריפוגה את התמיסה ב 8,820 x גרם במשך 1 דקה. בזהירות להסיר את supernatant מבלי להפריע חרוזים הצטברו בתחתית המיכל.
3. לשטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של סטרילי 10 mM HEPES pH 8.4 פתרון.
4. השהה מחדש את החרוזים המצופים PDL ב- 200 מ"ל של תמיסת 10 mM HEPES pH 8.4.

6. הכנת מיקרופיפטות

1. הכינו פיפטות מצינורות נימי זכוכית (קוטר פנימי של 1 מ"מ, קוטר חיצוני של 1.5 מ"מ) באמצעות מושך אלקטרודות אופקי. התאם הגדרות כך שהקצה החיצוני של המיקרופיפטה הנמשכת יהיה ~ 2-5 מיקרומטר. לפני המשיכה, ודא שצינורות הזכוכית נקיים.
2. תקנו פיפטות למגלשות זכוכית לאחסון, וודאו שהקצה אינו בא במגע עם פני השטח של המגלשה מכיוון שהקצה שביר. יש לאחסן בטמפרטורת החדר במיכל מכוסה כדי להגן מפני אבק. השתמש פיפטות באותו יום שבו הם נמשכים.

7. היצמדות PDL-חרוז לתאי עצב

1. הוסף 40-60 μL של חרוזים מצופים PDL שהוכנו בשלב 5 לתרבית תאים שהוכנה בשלב 4. מרכזו את קצה הפיפטה מעל תאי העצב, שנראים קלושים על הכיסוי, והוסיפו את החרוזים (ראו איור 4).
2. החזר את המדגם לאינקובטור למשך שעה אחת כדי לקדם היווצרות של מגעים סינפטיים.
3. לאחר הדגירה, הסירו את כל החרוזים שלא הודבקו על ידי שטיפה עדינה של התרבית עם NBM שחומם מראש.

8. הכנת תמיסת מלח פיזיולוגית (לניסויים בטמפרטורת החדר)

1. הכינו תמיסת מלח פיזיולוגית. זאת כדי לווסת את סביבת התא מחוץ לאינקובטור.
2. ודא את רמות האוסמולריות וה- pH.
3. להחדיר תמיסה ברציפות עם O₂ כדי למזער תנודות pH בעת ביצוע ניסויים.
4. מחממים לטמפרטורת החדר.
5. הגדר את מערכת הזילוח על ידי החדרת קצה אחד של צינור פלסטיק (מידות אופציונליות) בתמיסה פיזיולוגית O₂ וקיבוע הקצה השני למחט המוחדרת למחזיק הדגימה. הניחו את הצינורית והתמיסה גבוה יותר מהדגימה (ראו איור 5).
   1. נתקו את הצינור מהמחט וחברו אותו למזרק. השתמש מזרק להפעיל לחץ ולשאוב נוזל, מילוי הצינור. אוטמים עם מהדק רולר ומחברים מחדש את המחט.

9. מיקרומניפולציה של חרוזים

1. התקן את הדגימה במערך ניסוי כך שניתן יהיה לגשת לתאים מלמעלה על ידי שני מיקרופיפטות המותקנות במיקרומניפולטורים ולגשת אליהם אופטית מתחת, למשל, עם יעד פאזת 40X (צמצם מספרי של 0.6) של מיקרוסקופ אופטי הפוך. בתצורה זו, התקן מצלמת CCD ללכידת תמונה ביציאה הצדדית של המיקרוסקופ. חבר כל פיפטה למזרקים של 1 מ"ל באמצעות צינורות פלסטיק. בשלב זה, החליפו את NBM בתמיסת מלח פיזיולוגית (1-2 מ"ל) (ראו איור 5).
2. במהלך הניסויים, תאים מחוררים ברציפות עם תמיסת מלח פיזיולוגית שהוכנה בשלב 8 בקצב של 0.5-1 מ"ל / דקה.
3. בחר חרוז PDL שאינו מחובר לתא עצב בשדה הראייה. יישרו את החרוז עם קצה מיקרופיפטה על ידי התמקדות בחרוז ולאחר מכן עד למיקרופיפטה. הורידו את הקצה קרוב ככל האפשר לחרוז על ידי ניטור שלו דרך המיקרוסקופ.
4. החל לחץ שלילי עם מזרק 1 מ"ל מחובר פיפטה להרים את החרוז. שמרו על לחץ שלילי לאורך כל הניסוי.

10. משיכת נוירוטים

1. בחר חרוז PDL המחובר לתא עצב בשדה הראייה וחבר אותו למיקרופיפטה השנייה באמצעות יניקה כמתואר בשלבים 9.3-9.4.
2. משוך את קומפלקס PDL-חרוז-נוירון באיטיות (~ 0.5 מיקרומטר לדקה), הזז את המיקרומניפולטור או את שלב הדגימה ב -1 מיקרומטר ועצור למשך 5 דקות כדי לאפשר אתחול נוירוניט.
3. חזור על שלב 10.2 פעמיים.
   הערה: יש למשוך את 3 מיקרומטר הראשונים לאט מאוד כדי להבטיח הצלחה ניסיונית, המתרחשת מעל 95% מהזמן.
4. משוך את קומפלקס PDL-חרוז-נוירון על ידי הזזת המיקרומניפולטור או שלב הדגימה באיטיות (~0.5 מיקרומטר לדקה) ועצור למשך 5 דקות כדי לאפשר התארכות עצבית.
5. לאחר אתחול מוצלח והארכת הנוריט עבור 5 מיקרומטר הראשונים, משוך את הנוריט במהירות של 20 מיקרומטר לדקה על פני מרחקים בקנה מידה מילימטרי.
   הערה: משיכה יכולה להתבצע ברציפות או בשלבים ובקצב משתנה. ראו איור 6b-6c.

11. חיבור תאי עצב

1. בחר אזור עשיר בנוריטים והורד את קומפלקס PDL-חרוז-נוירוט כך שהוא יבוא במגע פיזי איתו. השתמשו בחרוזים אחרים כדי לאמוד את גובה הקצה מעל משטח הכיסוי. ראו איור 6ד.
2. השאר את קומפלקס PDL-חרוז-neurite במגע עם נוירוט המטרה תוך מניפולציה micropipette השני. מורידים את הפיפטה השנייה עם חרוז PDL השני על גבי הנוריט החדש שנוצר כ-20 מיקרומטר מהחרוז הראשון. השתמש בחרוז PDL השני כדי לדחוף את חוט הלהט העצבי החדש לכיוון תא המטרה.
3. החזיקו את שני החרוזים במקומם למשך שעה אחת לפחות. ודאו היעדר נפיחות מוקדית, עיבוי של הנוירוטים הבאים במגע עם החרוז, בעזרת המיקרוסקופ16.
4. במהלך הזמן הזה, השתמשו בזלוף כדי לשנות באיטיות את התווך של הדגימה ממי מלח פיזיולוגיים ל-NBM מחומם מראש, CO₂.
5. שחררו את החרוז מהפיפטה השנייה על ידי שחרור יניקה. אם הנוירוט החדש נשאר מחובר, שחררו גם את החרוז הראשון. ראו איור 6ה.
6. הסר בעדינות תמיסת מלח והחלף ב- NBM (~ 2 מ"ל).
7. הניחו בזהירות את הדגימה בחזרה באינקובטור כדי לחזק את הקשר העצבי לניסויים עתידיים. חיבור זה יציב עבור >24

תוצאות

איור 1: סטנדרטיזציה של תרביות עצביות באמצעות התקנים מיקרופלואידים7. (א) הרכבת מכשירים: כאשר המכשירים המיקרופלואידים מורכבים כראוי על משטח יבש, כל התאים גלויים. (ב) ציפוי תאים: לוחו היטב את התאים בפינה הימנית העליונה והתאים צריכים לנוע לכיוון הבאר השמאלית. (ג) צפיפות התא: מיד לאחר הציפוי, בדקו במיקרוסקופ אם ריכוז התאים מספיק. (d) אחרי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מכשירי נוירו	מכשירי Ananda		זמין מסחרית ב-http:// www.anandadevices.com
מס' 1 כיסוי זכוכית 25 מ"מ עגול	וורנר אינסטרומנטס	64-0705
צלחת תרבית תאים 35 מ"מ, לא פירוגנית, סטרילית	קורנינג בע"מ	430165
צלחת פטרי 95 מ "מ x 15 מ"מ, מכסה מחליק, פוליסטירן סטרילי	פישרברנד	FB0875714G
מדיום נוירובזלי	לייף טכנולוגיות	21103-049	פתרון חוץ-תאי
תוסף B-27 (50X), ללא סרום	תרמו פישר סיינטיפיק	17504044	פתרון חוץ-תאי
פניצילין, סטרפטומיוצין, גלוטמין	תרמו פישר סיינטיפיק	11995-065	פתרון חוץ-תאי
2 - 20 μL Pipettors קצוות עמידים בפני אירוסולים	תרמו פישר סיינטיפיק	2149P
פינצטה Dumont Dumostar 11 ס"מ	מכשירים מדויקים בעולם	500233
כלי דיסקציה	בראון, אסקולאפ
פולי-D-ליזין הידרוברומיד	סיגמא-אולדריץ'	P6407
מיקרו-חלקיקים על בסיס פוליסטירן, 10 מיקרומטר	סיגמא-אולדריץ'	72986
מושך פיפטה אופקי	סאטר אינסטרומנטס	חום-בוער P-97
מיקרומניפולטורים, סדרת PCS-5000 MC7600R	מכשירי SD	MC7600R
1 מ"ל מזרק	BD Luer-Lok	309628
מיקרוסקופ הפוך	אולימפוס	IX71
ממשקי משתמש אובייקטיביים2	אולימפוס	LUCPLFLN 40X
מצלמת CCD	פוטומטריה	אשד II: 512