יצירת תאי עצב על-ידי תכנות מחדש של תאי פיברובלסט עוריים אנושיים

תקציר

מקור: Shrigley, S., et al. פשוט דור של תרבית תפוקה גבוהה של נוירונים המושרים מפיברובלסטים של עור בוגר אנושי. J. Vis. Exp. (2018)

הסרטון מדגים את יצירת תאי העצב מפיברובלסטים עוריים אנושיים בוגרים (aHDFs). ה-aHDFs מתוכנתים מחדש באמצעות וקטור לנטי-ויראלי הנושא גנים עבור גורמי שעתוק עצביים ו-RNA קצר סיכת שיער (shRNAs). ה-shRNAs מעכבים את הביטוי של מדכא שעתוק עצבי, וגורמי השעתוק העצבי מפעילים גנים כדי להתמיין aHDFs לנוירונים. aHDFs מתוכנתים מחדש אלה מתורבתים במדיום המרה עצבי מוקדם ומאוחר כדי ליצור נוירונים בוגרים.

פרוטוקול

1. הכנת פיברובלסטים בעור לתכנות מחדש

1. באמצעות מערכת הפשרת תאים אוטומטית או אמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, הפשירו את הפיברובלסטים העוריים האנושיים הבוגרים (aHDFs) ופלטו 200,000 לכל בקבוק T75 (ספירה עם מונה תאים אוטומטי) ב-10 מ"ל של תווך פיברובלסטים (ראו טבלה 1) ב-37°C ב-5% CO₂.
2. בצע שינוי בינוני מלא עם מדיום פיברובלסט למחרת.
3. שנה את התווך פיברובלסט כל 3-4 ימים עד שהתאים מגיעים למפגש של 95%.
   הערה: בקבוק אחד יכיל כ-1,000,000 תאים.

2. ציפוי לתכנות מחדש (יום −1)

הערה: מומלץ להשתמש בציפוי ג'לטין לניסויים קצרי טווח (עד 30 יום); לחילופין, לניסויים ארוכי טווח מומלץ להתחיל בציפוי פולי-L-אורניתין, פיברונקטין ולמינין (PFL).

1. 60 דקות לפני ציפוי aHDFs לתכנות מחדש, לצפות צלחת 24 באר עם 0.1% ג'לטין (250 μL / באר) ולדגור ב 37 ° C.
2. שאפו את מדיום הפיברובלסטים על ה-aHDFs. יש לשטוף פעם אחת עם מלח חיץ פוספט (DPBS) של Dulbecco. נתק את התאים עם 0.05% טריפסין (1.5 מ"ל לכל צלוחיות T75) ב 37 ° C למשך 3-5 דקות.
3. הוסף מדיום פיברובלסט כדי לנטרל את הטריפסין (3 מ"ל להדחה לכל צלוחיות T75) ולאסוף את התאים המנותקים בצינור של 15 מ"ל על ידי שטיפת התאים בבקבוק פעמיים.
4. סובב את התאים למטה ב 400 x גרם במשך 5 דקות. להשליך supernatant ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של תווך פיברובלסט.
5. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי (כדי להבטיח המרה באיכות טובה, בדוק כי כדאיות התא היא מעל 90% עם צביעה כחולה טריפאן).
6. לקבלת צלחת שלמה של 24 בארות, הכינו תרחיף של 1,320,000 תאים ב-13.2 מ"ל של תווך פיברובלסטים כדי להשיג השעיה של 100,000 תאים/מ"ל של תווך (או 55,000 תאים/באר ב-550 מיקרוליטר של תווך פיברובלסטים כפול מספר הבארות הדרושות).
7. שואפים את הג'לטין מהצלחת ושוטפים פעמיים עם DPBS. הוסף 500 μL של תרחיף התא לכל באר ודגור לילה ב 37 ° C ב 5% CO₂.

3. התמרה ויראלית (יום 0)

הערה: עבודה עם חלקיקים לנטי-ויראליים דורשת ציוד מקטגוריה 2 ושימוש בסוכן כדי לנטרל את הנגיף. מומלץ מאוד גם ללבוש זוגות כפולים של כפפות.

1. התחממו 13.2 מ"ל של פיברובלסט בינוני עד 37 מעלות צלזיוס.
2. הפשרה וקטור לנטיויראלי המכיל את גורמי השעתוק achaete-scute family bHLH transcription factor 1 (Ascl1) ו-Brn2 עם שני RNA קצרים (shRNA) המכוונים לגורם שעתוק השתקת RE1 (REST) בטמפרטורת החדר.
3. הוסף את הנפח הדרוש של lentivirus כדי להדביק את aHDFs בריבוי של זיהום (MOI) של 20 למדיום ללא כל משפרי טרנסדוקציה.
   
4. החלף את התווך בצלחת 24 בארות בתווך פיברובלסט המכיל את הווקטור הלנטיויראלי (500 מיקרוליטר / באר) ודגור למשך הלילה ב 37 ° C ב 5% CO₂.
5. למחרת, להחליף את המדיום בבארות עם מדיום פיברובלסט טרי ללא וקטור lentiviral.
   הערה: המדיום נחשב מדבק במשך 7 ימים וככזה, יש להשתמש בהליכי הגנה וטיפול נאותים במהלך השבוע הראשון לאחר התמרה ויראלית.

4. תחזוקת התאים הממירים

הערה: ברגע שההמרה מתחילה, התאים רגישים להרמה; דאגו להטות את הצלחת כלפי מעלה והשתמשו בפיפט של 1,000 מיקרוליטר בעת הסרת המדיה כדי למנוע ניתוק תאים.

1. ביום השלישי, הסר את מדיום הפיברובלסטים והוסף 500 μL של מדיום המרה עצבי מוקדם (ראה טבלה 1).
2. פעמיים עד שלוש בשבוע, להוציא 225 μL של מדיום ישן מן הבאר ולהוסיף 250 μL של מדיום המרה עצבי מוקדם טרי.
3. ביום ה-18, הסר את כל התווך מכל באר והחלף ב-500 מיקרוליטר של מדיום המרה עצבי מאוחר (ראה טבלה 1).
4. המשיכו לשנות מחצית מהתווך כפי שצוין לעיל עם מדיום המרה עצבי מאוחר כל 2-3 ימים עד ליום ה-25 או נקודת הסיום של הניסוי (איור 1A).

טבלה 1. הרכב המדיות השונות בהן נעשה שימוש. תיאור מלא של הרכב המדיה הדרוש בפרוטוקול זה כולל מדיום פיברובלסט, מדיום המרה עצבי מוקדם, מדיום המרה עצבי מאוחר.

	ריכוז מלאי	ריכוז עבודה
Fibroblast medium
מדיום בסיסי	לא ישים	לא ישים
פניצילין/סטרפטומיצין	10,000 U/מ"ל	100 מ"ג/מ"ל
פ.ב.ס.	לא ישים	10%
Early neuronal conversion medium (ENM)
מדיום דיפרנציאציה עצבית	לא ישים	לא ישים
פניצילין/סטרפטומיצין	10,000 U/מ"ל	100 מ"ג/מ"ל
CHIR99021	10 מ"מ	2 מיקרומטר
SB-431542	20 מ"מ	10 מיקרומטר
נוגין	100 מיקרוגרם/מ"ל	0.5 מיקרוגרם/מ"ל
LDN-1931189	10 מ"מ	0.5 מיקרומטר
VPA	1 מטר	1 מ"מ
LM-22A4	20 מ"מ	2 מיקרומטר
GDNF	20 מיקרוגרם/מ"ל	2 נ"ג/מ"ל
NT3	10 מיקרוגרם/מ"ל	10 נ"ג/מיקרוליטר
db-cAMP	50 מ"מ	0.5 מ"מ
Late Neunal Conversion medium (LNM)
מדיום דיפרנציאציה עצבית	לא ישים	לא ישים
פניצילין/סטרפטומיצין	10,000 U/מ"ל	100 מ"ג/מ"ל
LM-22A4	20 מ"מ	2 מיקרומטר
GDNF	20 מיקרוגרם/מ"ל	2 נ"ג/מ"ל
NT3	10 מיקרוגרם/מ"ל	10 נ"ג/מיקרוליטר
db-cAMP	50 מ"מ	0.5 מ"מ

תוצאות

איור 1: התפתחות המרת iN לאורך זמן.(A) ציר הזמן של הניסוי ומפה של המבנה הארוז בלנטיוירוס המשמש לתכנות מחדש של פיברובלסטים עוריים אנושיים בוגרים. כל חץ שחור מייצג שינוי בינוני. (B) תמונות ניגודיות פאזה מייצגות המתארות את השינויים במורפולוגיה של תאים במהלך תהליך ההמרה בין יום 0 ליום 22 (כפי שמצוין בפינה הימנית העליונה של כל לוח). התמונות צולמו במיקרוסקופ ניגודיות פאזה ב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קווי תאים
פיברובלסטים עוריים אנושיים בוגרים			[קטע C2 #7] התורמת הייתה אישה בת 67. תאים שהתקבלו ממחקר מחלת פרקינסון וממרפאות מחלת הנטינגטון במרכז ג'ון ואן גסט לתיקון המוח (קיימברידג ', בריטניה).
ריאגנטים לתרבית פיברובלסט, התמרה והמרה
מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2]	גיבקו	14190094
טריפסין-EDTA [0.5%]	גיבקו	15400-054	לדלל ל 0.05% ב DPBS.
Virkon (סוכן המשמש לנטרול וירוס)	וירודרם	7511	לדלל לתמיסה 1% עם מים חמים.
מילי-קיו מים	מיליפור
מדיום בסיסי - מדיום עיט מעובד של Dulbecco (DMEM) + GlutaMax	גיבקו	61965059
פניצילין/סטרפטומיצין [10,000 U / מ"ל]	גיבקו	15140-122
סרום בקר עוברי (FBS)	גיבקו	10270-106
CryoMACS® דימתיל סולפוקסיד (DMSO) 10	מילטני	170-076-303
מדיום בידול עצבי - NDiff 227	טאקרה-קלונטק	Y40002
LM-22A4	טוקריס	4607	לדלל 10 מ"ג ב 1450 מיקרוליטר DMSO. ריכוז במלאי: 20 mM.
גורם נוירוטרופי הנגזר מקו תאי גליה (GDNF) [אדם רקומביננטי]	מערכות מו"פ	212-GD-010	לדלל 10 מ"ג ב 500 μL 0,1% BSA ב DPBS. ריכוז במלאי: 20 מיקרוגרם/מ"ל.
NT3 [אדם רקומביננטי]	מערכות מו"פ	267-N3-025	לדלל 25 מיקרוגרם ב 2,5 מ"ל 0.1% BSA ב DPBS. ריכוז במלאי: 10 מיקרוגרם/מ"ל.
db-cAMP	סיגמא אולדריץ'	D0627	לדלל 1 גרם ב 40,7 מ"ל מילי-Q מים. לסנן ולעשות 500 μL aliquots או צינורות מלאי של 10 מ"ל. ריכוז במלאי: 50 mM.
CHIR99021	אקסון	1386	לדלל 2 מיקרוגרם ב 429,8 μL DMSO. ריכוז במלאי: 10 mM.
LDN-193189	אקסון	1509	לדלל 2 מ"ג ב 360 מיקרוליטר DMSO. ריכוז במלאי: 10 mM.
חומצה ולפרואית מלח נתרן (VPA)	מרק מיליפור	676380	יש לדלל 5 גרם במים מסוג Milli-Q כדי להגיע לריכוז מלאי של 1 M. אזהרה: יש להימנע מבליעה, מגע עם העור והיווצרות אבק נשימה.
ריאגנטים לציפויים
ג'לטין	סיגמא אולדריץ'	G2500	לדלל עד 0.1% במי מילי-קיו.
פולי-L-אורניתין	סיגמא אולדריץ'	P3655	יש להמיס במי מילי-קיו. יש להשתמש במינון של 15 מיקרוגרם/מ"ל.
פיברונקטין	תרמופישר סיינטיפיק	33010-018	2 מ"ל מים מילי-קיו + 70 מיקרוליטר 0.25 מ' NaOH. יש להשתמש במינון של 5 מיקרוגרם/מ"ל.
למינין	תרמופישר סיינטיפיק	23017-015	יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C. יש להפשיר על קרח, לשמור על קירור וליטול 30 μL. יש להשתמש בטמפרטורה של 5 מיקרוגרם/מ"ל.
ציוד
בקבוק T75 [משטח דלתא Nunclon]	תרמופישר סיינטיפיק	156499
צלחת 24 בארות [Nunc]	תרמופישר סיינטיפיק	142485
1.5 מ"ל צינור פוליפרופילן	סיגמא אולדריץ'	Z336769
15 מ"ל צינור בז	זארשטדט	6,25,54,502
50 מ"ל צינור בז	זארשטדט	6,25,47,254
בקר Pippette			עבור נפחי צנרת 1-25 מ"ל.
פיפטות סרולוגיות סטריליות: 5, 10 ו 25 מ"ל	זארשטדט	86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001
צינורות נפח מתכווננים: 5, 20, 200 ו- 1,000 μL
טיפים סטריליים פיפטה			עבור נפחי צנרת של 0.5 - 1,000 μL.
מערכת הפשרת תאים אוטומטית ThawSTAR	BioCision	BCS-601
מונה תאים אוטומטי של הרוזנת השנייה	תרמופישר סיינטיפיק	AMQAX1000
תאי ספירת תאים [50 שקופיות] וכחול טריפאן [0.4%]	תרמופישר סיינטיפיק	C10228	לשימוש עם מונה תאים אוטומטי של Countess II.
מכסה מנוע זרימה למינרי
אינקובטור לח 5% CO2 37 °C
צנטריפוגה			מתאים לצינורות 1,5, 15 ו -50 מ"ל.
שייקר אורביטלי
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך	לייקה	DMI6000 ב