כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנה מראש
- הכינו מדיה של "עיבוד רקמות" ומדיה של "תחזוקת תרבית פרוסות" יום לפני כריתת הגידול המתוכנן ואיסוף רקמות (או השתמשו במדיה שנוצרה בעבר תוך שבועיים). הוסף 5 מ"ל של תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) ו- 5 מ"ל של 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ל- 500 מ"ל של מדיום Eagle מותאם של Dulbecco עתיר גלוקוז (DMEM) כדי ליצור את מדיום עיבוד הרקמות.
- הכינו 250 מ"ל של תחזוקת תרבית פרוסה באמצעות בסיס של תווך עצבי (למשל, נוירובזל) ללא פנול אדום. השלם מדיום זה עם 10 mM HEPES, 1x תוסף B-27, 400 μM L-גלוטמין, 600 μM L-alanyl-L-גלוטמין dipeptide, 60 U/mL פניצילין, 60 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 6 U / mL nystatin.
- יש לאחסן את כל חומרי ההדפסה בטמפרטורה של 4°C למשך לא יותר משבועיים.
2. יום הניתוח: רכישת רקמות
- ביום רכישת הרקמות, להכין 50 - 100 מ"ל של 1% ו 2% (wt/vol %) פתרונות של טמפרטורת התכה נמוכה agarose במדיה עיבוד רקמות באמצעות כלי זכוכית autoclaved וטכניקה סטרילית במכסה מנוע זרימה למינרית. שני הריכוזים של אגרוז נחוצים כדי להתאים לשונות בלתי צפויה בעקביות רקמת הגידול.
- מחממים את ההשעיה agarose, באמצעות מיקרוגל, עד רתיחה עדינה הוא ציין. הניחו את תמיסת האגרוז באמבט מים בטמפרטורה של 37°C כדי לשמור במצב נוזלי עד לשימוש.
- מניחים 1 מ"ל של תחזוקת תרבית פרוסה בכל באר של צלחת 6 בארות.
- השתמש במלקחיים סטרילית כדי להניח תוספות תרבית פוליטטרה-פלואוראתילן ריקות (PTFE) בכל באר. הניחו את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות לח ומכוסה מים עם אטמוספירה של 5% CO2 הנשמרת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- בעזרת פיפטה סטרילית של פסטר במכסה מנוע זרימה למינרית, מבעבעים תערובת של גז 95% O2/5% CO2 לתוך בקבוק המכיל מדיה לעיבוד רקמות קרות כקרח למשך כ-15 עד 30 דקות, לפני רכישת רקמת הגידול. השימוש במדיה על-מחומצנת ממזער היפוקסיה ברקמה בתפזורת במהלך העיבוד.
- הכינו צינורות חרוטיים מסומנים של 50 מ"ל (מספיק כדי לבודד את המספר הרצוי של אזורי גידול בודדים) המכילים 20 מ"ל אליציטוטים של חומר עיבוד קר כקרח על-מחומצן להובלת רקמות בין חדר הניתוח למתקן החיתוך.
- בשיתוף עם נוירוכירורג, לתכנן מראש את אזור הגידול לרכישת דגימה. בחר אזור גידול עם שיפור ניגודיות כפי שמודגם בהדמיה הקלינית של המטופל (רצפי דימות תהודה מגנטית פוסט-גדוליניום T1 (MRI). ניסיון העבר מצביע על כך שאזור זה מניב רקמת גידול בת קיימא בניגוד לרקמה נמקית.
הערה: נעשה ניסיון ליצור פרוסות מהחומר הלבן (הפריטומורלי) שמסביב; עם זאת, אוטופלואורסצנטיות ברקע וירידה בצפיפות תאי הגידול הגבילו את התועלת הניסיונית של פרוסות אלה.
- להשיג רקמת גידול לקראת תחילת כריתת הגידול. הימנעו מאיסוף רקמת גידול החשופה לצריבה דו-קוטבית נרחבת, העלולה לפגוע בכדאיות הרקמה משנית לפגיעה תרמית. דגימות רקמה שנרכשו במהלך כריתת הגידול הדגימו כדאיות משופרת בהשוואה לרקמה שנרכשה מכריתות ארוכות בגוש. תצפית זו עשויה להתייחס להפרעה דיפרנציאלית של רקמת הגידול בזרימת הדם כתוצאה מכריתה כירורגית והארכת זמן הרכישה.
- אם תרצה, תייג ואחסן רקמת גידול בצינורות חרוטיים נפרדים כדי לבודד דגימות מאזורי גידול נפרדים. (כלומר רקמת גידול שטחית לעומת עמוקה). ניתן לתעד מיקומי רקמות מדויקים אם/כאשר קיים ניווט כירורגי תוך ניתוחי.
3. הכנת תרבית פרוסות
- מניחים חתיכות רקמת גידול בצלחת פטרי עם אמצעי עיבוד קרים כקרח. כדי לשטוף את רקמת הגידול ולמזער תאי דם אדומים דבקים, השתמש פיפטה כדי להחליף בעדינות ולהשליך את המדיה בצלחת פטרי שלוש פעמים.
- בעזרת אזמל, חותכים חתיכות גידול לצורות קופסה מלבניות. חתוך חתיכות רקמה לערך 3 מ"מ x 3 מ"מ x 10 מ"מ. יש להסיר בזהירות את כל כלי הדם המחוברים באמצעות כריתה או מתיחה עדינה בעזרת מלקחיים עדינים.
- פיפטה 5 - 7 מ"ל של 37 ° C agarose לתוך קובייה קטנה בצורת קובייה (~ 2 ס"מ3) פלסטיק הטבעה עובש. יש לאשר שהטמפרטורה של תמיסת אגרוז אינה עולה על 37 מעלות צלזיוס עם מדחום סטרילי לפני השימוש.
- הניחו לאגרוז לשבת כדקה על מצע קרח.
- מניחים 2 - 4 רקמת גידול "רצועות" לתוך agarose עם ציר ארוך בכיוון אנכי. הערה: רצועות רקמה נוטות "לשקוע" באגרוז לפני התמצקות. כדי למנוע סיבוך זה, החזק באופן זמני את רצועת הרקמה בכיוון אנכי עד שהאגרוז יתמצק עוד יותר.
- שמור את הרקמה המכילה עובש agarose על מצע קרח במשך 2 - 5 דקות כדי להקל על התמצקות.
- מוציאים עובש מקרח ומסירים בעדינות את גוש האגרוז על ידי חיתוך דפנות הטופס באזמל. הימנעו מהפעלת כוח מופרז על הבלוק, שעלול לשבור את האגרוז.
- השתמשו בטיפה נדיבה של דבק ציאנואקרילט כדי להצמיד את גוש האגרוז לצלחת דגימת הוויברטום. מניחים לדבק להתייצב למשך כ-1-2 דקות.
- מלאו את מאגר הוויברטום באמצעי עיבוד קרים כקרח כדי לטבול את גוש האגרוז המודבק על צלחת הדגימה.
- במהלך החיתוך, מבעבעים תערובת גז 95% O2 / 5% CO2 לתוך מאגר הוויברטומה דרך פיפטת פלסטיק סטרילית גזורה.
- הגדר את עובי פרוסת הוויברטומה ל 300 - 350 מיקרומטר.
- התאם את מהירות התקדמות הלהב ואת משרעת הלהב בהתאם לעקביות הרקמות. רקמת גליובלסטומה "נוקשה" יותר דורשת מהירויות מתקדמות איטיות יותר של הלהב ומשרעת גבוהה יותר. מהירות הלהב המדויקת והגדרות המשרעת ישתנו בהתאם למפרטי הוויברטום.
הערה: מספר בעיות מתעוררות בדרך כלל במהלך החיתוך. אם רצועת הרקמה מתנתקת מגוש האגרוז, נסו להטמיע את הרקמה באגרוז בריכוז גבוה יותר. אם פרוסות הגידול עבות מהרצוי (ערכת מכונות), או שהן אסימטריות, הגדילו את המשרעת והפחיתו את מהירות להב הוויברטום. כדי להבטיח שרקמת הגידול לא תידבק או "תיגרר" על ידי מחזיק הלהב, בעת החיתוך, מקם בזהירות את המיקרו-מרית בין מחזיק הלהב לפרוסה, תוך כדי תנועת הלהב.
- מעבירים פרוסות רקמה לצלחת פטרי עם אמצעי עיבוד קרים כקרח באמצעות מיקרו-מרית מנירוסטה.
- השג מאינקובטור לוחות בעלי 6 בארות המכילות תוספות PTFE ומדיית תרבית פרוסה מאוזנת (כפי שהוכן בסעיף 2, שלב 4).
- פרוסות רקמת צלחת באמצעות מיקרו-מרית מנירוסטה. צמצם מגע ישיר ומניפולציה של רקמה באמצעות מברשת צבע קטנה עם זיפים עדינים כדי ליצור "גל נוזל" כדי לדחוף בעדינות את הפרוסה מהמרית אל עלית התרבית.
הערה: צמצם את כמות מדיית העיבוד המוכנסת על גבי תוספת תרבית הרקמה. אם כמויות מוגזמות של מדיה מועברות וגורמות לפרוסות לצוף, השתמשו בפיפטת פסטר סטרילית כדי להסיר מדיה.
- החזירו את לוחות 6 הקידוחים המכילים פרוסות גידול לאינקובטור הנשמר בטמפרטורה של 37°C עם אטמוספירה של 5% CO2.
הערה: יש להשלים את כל פרוטוקול ההטבעה והחיתוך תוך 90 דקות מרגע רכישת רקמת הגידול מחדר הניתוח.
4. תחזוקת תרבות פרוסות
- לאחר 12 - 24 שעות, מעבירים את תרביות הפרוסה על ידי אחיזה בכל שפה עם מלקחיים סטריליים, ומעבירים לצלחות המכילות מצע תחזוקת תרבית פרוסה טרייה. יש לוודא שאמצעי תחזוקת תרבית הפרוסות המשולבים בכל באר מתאזנים באינקובטור למשך 15 דקות לפחות לפני העברת התוספות.
- מעבירים את התוספות לצלחות חדשות בנות 6 בארות עם תרבית פרוסות טרייה ומאוזנת כל 48 שעות.
- אם תרצה, aliquot פרוסה ישנה תרבית מדיה עם פיפטה לשימוש מיידי בבדיקות ביוכימיות או להקפיא ב -80 ° C לשימוש עתידי.
