פיתוח מודל תרבית תאים משולשת של מחסום הדם-מוח האנושי

תקציר

מקור: Fattakhov, N., et al. מודל תרבית תאים ראשוני משולש של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה. J. Vis. Exp.(2022)

סרטון זה מדגים את ההתרבות המשותפת של פריציט במוח האנושי, אסטרוציטים ותאי אנדותל. כל שכבת תא נוצרת בנפרד ולאחר מכן מתורבתת יחד, מה שיוצר מערכת תלת שכבתית המחקה את הסידור התאי של מחסום הדם-מוח

פרוטוקול

1. הגדרת מודל BBB של תרבית תאים משולשת

1. זריעת פריציטים
   1. יש לטפח HBVP (פריציטים של כלי דם במוח האדם) בצלוחיות תרבית T75 עם משטח פעיל להידבקות תאים בתוך אינקובטור_CO2 של 5% בטמפרטורה של 37°C עד למפגש. לאחר שמגיעים למפגש, שאפו את מדיום הפריציטים הישן ושטפו את התאים עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט חם של דולבקו (DPBS). לשאוף את DPBS ולנתק את התאים מן הבקבוק באמצעות שילוב של 4 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA חמה ו 1 מ"ל של DPBS.
      הערה: הימנע משימוש בקטעים מאוחרים יותר מ-P7.
   2. לדגור על הבקבוק במשך 5 דקות ב 37 ° C באינקובטור CO₂. צפה תחת מיקרוסקופ כדי לאשר אם התאים מנותקים מהבקבוק. הוסף 5 מ"ל של מדיום פריציטים חם (המכיל 2% נסיוב בקר עוברי [FBS]) לבקבוק והעבר את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
   3. צנטריפוגה את תרחיף התא במשך 3 דקות ב 200 × גרם, המאפשר לתאים ליצור גלולה בתחתית הצינור. שאפו את התווך מהצינור, וודאו שכדור התא נשאר שלם.
   4. להשעות מחדש את גלולת התא בתווך פריציט; לחשב את כמות המדיום בהתאם למפגש של התאים ואת מספר תוספות היטב הדרוש. קח 10 μL של התאים המרחפים מחדש, מקם אותם בשקופית ספירת תאים, וספור את מספר התאים.
   5. קבע את צפיפות התא וזרע 300,000 תאים / הכנס 1 מ"ל של תווך פריציטים לצד הבלומינלי של התוספות היטב (פורמט 6-well).
      הערה: כאשר זורעים HBVP בחלק התחתון של התוספות, חשוב להפוך את הלוחות המוכנסים היטב הפוך. בזמן שהצלחת מונחת שטוחה על משטח, הסירו את החלק התחתון כדי לחשוף את הצד האבומינלי של תוספות הבאר. כסו את התוספות היטב עם הצלחת ההפוכה לאחר הוספת תרחיף תאי פריציטים לצד האבלומינלי כדי למנוע אידוי. שמור את כל הצלחות הפוכות באינקובטור 5% CO₂ ב 37 ° C למשך הלילה.
2. זריעת אסטרוציטים
   1. טפחו HA (אסטרוציטים אנושיים) בצלוחיות T75 בתוך אינקובטור_CO2 של 5% בטמפרטורה של 37°C עד למפגש ביניהם. בצע את השלבים לעיל 1.1.1-1.1.4 באמצעות מדיום אסטרוציטים (המכיל גם 2% FBS) במקום pericyte medium.
      הערה: הימנע משימוש בקטעים מאוחרים יותר מ-P9.
   2. לקבוע את צפיפות התא ולזרוע 300,000 תאים / באר על החלק התחתון של תרבית הרקמה 6-באר צלחות. כסו את הצלחת כדי למנוע אידוי ושמרו את כל הצלחות באינקובטור של 5% CO₂ בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
3. זריעת תאי אנדותל
   1. יש לטפח HBMEC (תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האדם) בצלחות תרבית רקמה בתוך אינקובטור של 5% CO₂ בטמפרטורה של 37°C עד למפגש. בצע את השלבים לעיל 1.1.1-1.1.4 באמצעות מדיום קלאסי מלא (המכיל 10% FBS) במקום מדיום pericyte.
      הערה: הימנעו משימוש במעברים מאוחרים יותר מ-P12.
   2. הוציאו את תרבית הרקמה צלחות 6 בארות המכילות אסטרוציטים ואת תוספות הבאר (פורמט 6 בארות) המכילות פריציטים מאינקובטור 5% CO₂ ב 37 מעלות צלזיוס. שאפו את תווך האסטרוציטים מתרבית הרקמה 6 צלחות באר. הוסף 1 מ"ל של מדיום פריציטים ו 1 מ"ל של מדיום אסטרוציטים לכל באר.
   3. שואפים את תווך הפריציטים מהחדרות הבאר ומניחים אותו בתרבית הרקמה 6 צלחות באר המכילות את האסטרוציטים שנזרעו. זרע HBMEC בצפיפות של 300,000 תאים/באר ב-2 מ"ל של התווך הקלאסי השלם על הצד האפי של אותה באר מוסיף.
      הערה: את תאי האנדותל יש לזרוע בצד האפי של תוספות הבאר למחרת לאחר זריעת פריציטים בצד האבלומינלי של תוספות הבאר ואסטרוציטים על צלחות תרבית רקמה 6 בארות. תאים צריכים להישמר בתרבית משולשת במשך שישה ימים כדי לגרום לתכונות דמויות BBB. יש לשנות את מדיום תרבית התאים בשני התאים המוחדרים היטב 24 שעות לפני הניסויים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
24 מ"מ Transwell עם תוספת קרום פוליאסטר נקבוביות 0.4 מיקרומטר	קורנינג	3450
35 מ"מ זכוכית תחתונה כלים	MatTek מדעי החיים (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
אסטרוציטים בינוניים	תא מדע	1801
גורם התקשרות	מערכות תאים (Fisher Scientific)	4Z0-201
מדיום קלאסי מלא עם סרום ו-CultureBoost	4Z0-500	מערכות תאים
צינורות צנטריפוגות קורנינג 50 מ"ל PP (תחתית חרוטית עם מכסה צנטריסטאר	VWR	430829
קורנינג 75 ס"מ² צוואר משומר בצורת U לא מטופל בקבוק תרבית תאים	קורנינג	431464U
קורנינג CellBIND 96-באר שטוח שקוף תחתון שחור פוליסטירן Microplates	קורנינג	3340
ספירת שקופיות תא ספירת תאים	תרמו פישר סיינטיפיק	C10228
מונה תאים אוטומטי Countess II FL	תרמו פישר סיינטיפיק	ZGEXSCCOUNTESS2FL
DMEM בינוני (ללא גלוקוז, ללא גלוטמין, ללא פנול אדום)	תרמופישר	A14430-01	מדיום ללא גלוקוז
DPBS (ללא סידן, ללא מגנזיום)	תרמופישר	14190250
EBM אנדותל גידול תאים בסיסי בינוני, ללא פנול אדום, 500 מ"ל	לונזה	CC-3129
אינקובטור CO2
צנטריפוגה