$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. סינתזה של ג'לטין methacryloyl (GelMA)
- שוקלים 10 גרם ג'לטין המתקבל מעור חזירי ומתמוססים ב -100 מ"ל של PBS על ידי מתן התמיסה לערבב על צלחת חימום ב 240 סל"ד ו 50 ° C עד להמסה מלאה.
- מתחת למכסה המנוע, הוסף 2 מ"ל של אנהידריד מטאקרילי (MA) לרמה נמוכה של פונקציונליות, ותן לתחליב הג'לטין לערבב ב 240 סל"ד ו 50 ° C במשך 2 שעות < / >
זהירות: הצהרת סיכון MA: H302 + H332 (מזיק בבליעה או בשאיפה), H311 (רעיל במגע עם העור), 314 (גורם לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים), 315 (גורם לגירוי בעור), H317 (עלול לגרום לתגובה אלרגית לעור), H318 (גורם לנזק חמור לעיניים), 331 (רעיל אם נשאף), H332 (מזיק אם נשאף), H335 (עלול לגרום לגירוי נשימתי). הנחיות טיפול: P261 (הימנעו מנשימת אבק/אדים/גז/ערפל/אדים/תרסיס), P305 + P351 + P338 + P310 (אם אתם בעיניים: יש לשטוף בזהירות במים במשך מספר דקות. הסירו עדשות מגע, אם הן קיימות וקלות לביצוע. המשיכו לשטוף. התקשר מיד למרכז רעלים/רופא), P301 + P312 + P330 (אם אתה מרגיש לא טוב. לשטוף את הפה).
הערה: מוסיפים MA לאט מאוד, טיפה אחר טיפה.
- לדלל את תמיסת הג'לטין-MA ב 100 מ"ל של PBS שחומם מראש (50 ° C) כדי לקבל 200 מ"ל של נפח סופי ולתת לתמיסה לערבב ב 240 סל"ד ו 50 ° C במשך 10 דקות.
- חותכים ~ 20 ס"מ של קרום דיאליזה (חיתוך מולקולרי 12-14 kDa) ומשרים אותו במים נטולי יונים, עד שהוא רך.
הערה: מלאו את הממברנות במים נטולי יונים, כדי להבטיח שאין חורים או פגמים.
- באמצעות משפך, להעביר את תמיסת ג'לטין-MA לממברנות.
הערה: סוגרים את שני הצדדים ומשאירים מקום נוסף בפנים כדי לאפשר תערובת.
- מניחים את הממברנות המכילות את תמיסת הג'לטין-MA במיכל עם 2 ליטר מים מזוקקים לדיאליזה, ונותנים להם לערבב ב 40 ° C במשך 5 ימים (500 סל"ד).
הערה: כסו את המיכל כדי למנוע אידוי מים.
- החליפו את המים המזוקקים פעמיים ביום. בכל פעם, להפוך את הממברנות הפוך עבור הומוגניזציה.
- ביום החמישי, יש לערבב 200 מ"ל של מים אולטרה-טהורים שחוממו מראש (40°C) עם הג'לטין-MA המחויג ולערבב במשך 15 דקות בטמפרטורה של 40°C.
- העבר את תמיסת הג'לטין-MA לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל עד 25 מ"ל ותן לצינורות להישאר ב -80 ° C למשך יומיים.
הערה: אחסן את הצינורות בצורה אופקית כדי להקל על ליופיליזציה.
- Lyophilize את התמיסות הקפואות במשך 3-5 ימים ולאחסן את GelMA lyophilized מוגן מפני לחות.
2. הכנת ביודיו
הערה: על מנת להשיג 1 מ"ל של ביו-דיו, מומלץ לייצר לפחות 3 מ"ל של תמיסה ביו-חומרית, מכיוון שייתכנו הפסדים במהלך הסינון.
- הכנת תמיסת פיברינוגן
- הכינו תמיסת מלח (NaCl 0.9%) במים שעברו דה-יוניזציה, והמיסו 10 מ"ג פיברינוגן מפלזמת בקר ב-1 מ"ל של תמיסת המלח כדי לקבל ריכוז של 10 מ"ג/מ"ל
הערה: מכיוון שפיברינוגן סופח לזכוכית, אין להשתמש בצלוחיות זכוכית להכנת תמיסת הפיברינוגן.
- השאירו את התמיסה תחת תסיסה ב 37 °C עד המסה מלאה של פיברינוגן.
הערה: להמסת פיברינוגן, השתמש במערכת סיבובית הממוקמת בתוך תנור ב 37 ° C. תסיסה מגנטית (180 סל"ד) של פיברינוגן על צלחת חמה ב 37 ° C מתאים גם. במצב זה, פיברינוגן 10 מ"ג / מ"ל לוקח בערך 40 דקות להתמוסס.
- הכנת תמיסת ג'לטין/GelMA
- שקול 0.12 גרם של ג'לטין ולהוסיף אותו 1.9 מ"ל של PBS שחומם מראש (40 ° C) כדי לקבל ריכוז סופי של 4% (w / v) ג'לטין. מערבולת כדי להקל על פירוק.
- שמור את התחליב על 40 ° C עד המסה מלאה.
- שוקלים 0.06 גרם של GelMA lyophilized ומעבירים אותו לתמיסת הג'לטין כדי להשיג ריכוז סופי של 2% (w/v) GelMA. מערבולת כדי להקל על פירוק.
- שמור את התמיסה בטמפרטורה של 40°C עד להמסה מלאה.
3. הכנת ביודיו ג'לטין/ג'למה/פיברינוגן עמוס אסטרוציטים
- פיפטה 0.9 מ"ל של תמיסת פיברינוגן 10 מ"ג / מ"ל והעברה לתמיסת ג'לטין / GelMA לקבלת ריכוז סופי של 3 מ"ג / מ"ל של פיברינוגן.
- לשקול 0.015 גרם של photoinitiator (PI) ולהעביר את ג 'לטין / GelMA / תמיסת פיברינוגן כדי לקבל ריכוז סופי של 0.5% (w / v) PI. ערבב את התמיסה על ידי הפיכת הצינור למעלה ולמטה ושמור אותו ב 40 ° C מוגן מפני אור כדי למנוע השפלה PI.
הערה: מלאי הדיו הביולוגי ב-4°C למשך 24 שעות לכל היותר.
- מתחת לזרימה הלמינרית, סנן את התמיסה באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל.
הערה: הפתרון הביו-חומרי צריך להיות בטמפרטורה של 37-40 מעלות צלזיוס כדי לאפשר סינון.
- העברת 980 μL של הפתרון הביו-חומרי לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
- לדלל למינין בתמיסת מלח כדי לקבל תמיסת מלאי של 100 מיקרוגרם / מ"ל.
- פיפטה 20 μL של למינין ולהעביר לצינור המכיל את bioink כדי לקבל ריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל למינין.
- מערבבים בעדינות על ידי פיטום למעלה ולמטה, תוך הימנעות מבועות. אם בועות כלשהן נמשכות, צנטריפוגו את הצינור החרוטי ב 200 x גרם במשך 2 דקות. שמור את הדיו הביולוגי בטמפרטורה של 37°C עד שהוא מעורבב עם התאים.
- טריפסיניזציה של אסטרוציטים ראשוניים עם 0.05% טריפסין למשך 5 דקות
הערה: השתמש באסטרוציטים ממעברים 1 עד 3.
- נטרלו את פעילות הטריפסין עם FBS ביחס של 1:1 והעבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. צנטריפוגה אותו ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
- ספרו את התאים והעבירו 1 x 106 תאים לצינור חרוטי אחר. צנטריפוגה אותו ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
- הסר את supernatant משאיר נפח קטן (~ 200 μL) כדי להשעות את גלולת התא, על ידי הקשה עדינה על החלק התחתון של הצינור החרוט.
- להעביר 1 מ"ל של ג'לטין / GelMA / תמיסת פיברינוגן לצינור המכיל את התאים בעדינות פיפטה למעלה ולמטה הומוגני, קבלת ריכוז סופי של 1 x 106 תאים / מ"ל.
3. הכנת פתרון crosslinker
- חוקה מחדש של תרומבין
- הכינו תמיסת ציר של תרומבין 100 U/mL במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה עם אלבומין בסרום בקר (BSA) של 0.1% (w/v) בצינור חרוטי של 15 מ"ל. מלאי במיקרו-צינורות ב -20 °C.
הערה: מכיוון שתרומבין סופח זכוכית, אין להשתמש בצלוחיות זכוכית להכנת תמיסת המלאי או לאחסן את האליציטוטים.
- הכנת תמיסת טרומבין-CaCl2
- פיפטה 100 μL של תמיסת מלאי טרומבין והעברה לצינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 8.9 מ"ל של מים סטריליים deionized כדי לקבל ריכוז סופי של 1 U/mL thrombin.
- הכינו תמיסת CaCl2 10% (w/v) במים שעברו דה-יוניזציה וסטריליזציה באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
- העבר 1.1 מ"ל של תמיסת CaCl2 10% לצינור החרוטי המכיל טרומבין על מנת לקבל יחס סופי של 1:9 (CaCl2 לתרומבין).
הערה: הכן את פתרון crosslinker בנפח עבור הניסוי, הימנעות אחסון.
4. הדפסה ביולוגית של דיו ביולוגי עמוס אסטרוציטים באמצעות מדפסת ביולוגית מבוססת שחול
- עיצוב הרקמה העצבית
- שימוש בקוד G: בניית רשת של 6 x 6 מ"מ (צורה בריבוע) עם מרחק של 1 מ"מ בין כל קו מודפס ביולוגית על ציר X וציר Y, ו-6 שכבות על ציר Z (0.2 מ"מ בין כל שורה); הגדר את האקסטרוזיה (E) ל- 0.01 מ"מ, הגדלת 0.001 מ"מ בכל שכבה חדשה של ציר Z; והגדר את מהירות ההדפסה (F) ל- 400 מ"מ/דקה (מידע משלים).
- הגדרת מדפסת ביולוגית
- חשוף את המכונה לאור UV במשך 15 דקות, ולאחר מכן לנגב אותו עם אתנול 70%.
- הפעל את המדפסת הביולוגית באמצעות מתג ההפעלה. חבר את ההתקן למחשב באמצעות כבל USB. פתח את תוכנת הבקרה כדי לחבר אותה למדפסת הביולוגית וטען את עיצוב הקובץ.
- הכנת מזרק הדפסה ביולוגית
- העבר את ביודיו הג'לטין/GelMA/פיברינוגן עמוס האסטרוציטים למזרק פלסטיק של 5 מ"ל באמצעות פיפטה של 1,000 μL.
הערה: מעבירים לאט כדי למנוע היווצרות בועות.
- חבר מחט קהה סטרילית 22 G למזרק.
הערה: השאירו את המזרק על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
- חבר את המזרק לראש ההדפסה של המדפסת הביולוגית ושטוף ידנית את הדיו הביולוגי כדי להסיר את הבועות שנותרו.
- הדפסה ביולוגית
הערה: ההדפסה הביולוגית בוצעה מחוץ למכסה המנוע הלמינרי.
- הניחו צלחת תרבית בקוטר 35 מ"מ על שולחן המדפסת הביולוגית ומקמו את המחט במרחק של 0.1 מ"מ משטח צלחת התרבית כדי לאפשר תנועת מחט.
הערה: השתמש בכלי תרבית אחד בקוטר 35 מ"מ עבור כל הדפסה ביולוגית.
- לחץ על לחצן הדפס.
- לאחר סיום ההדפסה הביולוגית, ודא שהמזרק מתרחק מהמנה. לאחר מכן, סגרו את צלחת התרבית והתכוננו לתהליך ההצלבה.
הערה: הדפסה ביולוגית של מבנה אחד אורכת כדקה ו-10 שניות.
- הצלבה בין המבנה המודפס הביולוגי לבין התרבות
- מניחים את צלחת התרבית תחת אור UV ב 2 mW / cm2 עבור 2 x 60 s (למעלה ולמטה) עבור GelMA crosslinking.
- מתחת לזרימה הלמינרית, מעבירים את המבנה המודפס ביולוגית לצלחת בת 24 בארות באמצעות מרית סטרילית.
- הוסף 500 μL של תמיסת טרומבין/CaCl2 והשאר למשך 30 דקות כדי לאפשר קישור פיברין.
- הסר את פתרון crosslinking ולשטוף את המבנה עם 2 מ"ל של PBS 1x. לאחר מכן, החלף את PBS עם 1 מ"ל של תרבית אסטרוציטים בינוני לדגור ב 37 ° C ו 5% CO2. שנה את המדיום כל 3 ימים.