כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. תיולציה של חומצה היאלורונית
NOTE: יחסים מולאריים מצוינים ביחס למספר כולל של קבוצות קרבוקסילט, אלא אם צוין אחרת.
- יש להמיס 500 מ"ג נתרן היאלורונט (HA, 500-750 kDa) ב-10 מ"ג/מ"ל במים מזוקקים ונטולי יונים, (DiH2O) בצלוחית Erlenmeyer מעוקרת באוטוקלאב. ערבבו את התמיסה (~200 סל"ד) בטמפרטורת החדר במשך שעתיים כדי להמיס חומצה היאלורונית במלואה. השתמשו במוט ערבוב ובצלחת ערבוב מגנטית כדי לשמור על התגובה מעוררת במהלך הליך התיולציה.
- באמצעות 0.1 M חומצה הידרוכלורית (HCl), להתאים את ה- pH של תמיסת HA ל 5.5. שקול 69.6 מ"ג (יחס מולארי של 0.25x) של 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
הערה: למרות שניתן להוסיף EDC לא מומס ישירות לתמיסת HA, בדרך כלל קל יותר להמיס את EDC תחילה ב- 1 מ"ל של DiH2O ולאחר מכן להוסיף במהירות את תמיסת EDC לתמיסת HA. טרום פירוק ב 1 מ"ל של DiH2O יכול להיעשות גם עם N-hydroxysuccinimide (NHS) ו cystamine dihydrocholoride לפני הוספת התגובה בשלבים 1.3 ו 1.4.
- הוסף 17.9 מ"ג (יחס מולארי 0.125x) של NHS לתגובה. התאימו את רמת החומציות של תמיסת התגובה ל-5.5 באמצעות 0.1 M HCl ודגרו על התגובה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
- הוסף 70.0 מ"ג (יחס מולארי של 0.25x) של ציסטמין דיהידרוכלוריד לתמיסת התגובה. השתמש 0.1 M נתרן הידרוקסידי (NaOH) כדי להתאים pH ל 6.25. יש לדגור על התגובה בטמפרטורת החדר למשך הלילה תוך כדי ערבוב.
- למחרת, השתמש ב- 1 M NaOH כדי להתאים את ה- pH של תמיסת התגובה לסביבות 8. הוסף 192 מ"ג (יחס מולארי 4x) של dithiothreitol (DTT) לתגובה. יש להחזיר את רמת החומציות ל-8 לאחר הוספת DTT ולערבב למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.
- השתמש 1 M HCl כדי להתאים pH ל 4. מעבירים את תערובת התגובה כולה לתוך קרום דיאליזה מושרה מראש (חיתוך משקל מולקולרי סביב 13 kDa) ו dialyze כנגד DiH2O מותאם מראש pH 4.
הערה: נפח DiH2O לדיאליזה צריך להיות לפחות פי 40 מהנפח של תמיסת HA מגיבה (למשל, דגימה של 50 מ"ל ב-2 ליטר של DiH2O, pH 4).
- יש להחליף את תמיסת הדיאליזה (DiH2O, pH 4) פעמיים ביום למשך 3 ימים בטמפרטורת החדר.
- סנן את התמיסה המחוייגת דרך קרום 0.22 מיקרומטר, מסנן מונע ואקום. תמיסת הקפאת הבזק של חומצה היאלורונית מגולגלת בחנקן נוזלי. השתמש lyophilizer להקפיא דגימות יבשות במשך 2 ימים. ניתן לאחסן חומצה היאלורונית (HA) בצורה יבשה במייבש אטום בוואקום בטמפרטורה של -20°C למשך 6 חודשים לפחות.
- כדי לקבוע את מידת התיולציה, השתמש בבדיקת אלמן ו/או בספקטרוסקופיית NMR פרוטון.
2. הכנת חומרי קרוסלינקינג
- יש להמיס חומצה היאלורונית ממוססת בריכוז הרצוי (בדוגמה זו, 13.3 מ"ג/מ"ל) במי מלח חוצצים HEPES (20 mM HEPES במאגר מלח מלח מאוזן של Hank (HBSS), מותאם ליפול בתוך pH של 8-9) בבקבוקון ענבר כדי למזער את החשיפה לאור הסביבה. שמור על התמיסה תוך ערבוב מתמיד.
הערה: היווצרות קשרים דיסולפידים בין תיולים מצומדים לחומצה היאלורונית עלולה להתרחש אם רמת החומציות גבוהה מ-8, ריכוז התמיסה גבוה מדי, או אם התמיסה נשארת ערבוב זמן רב מדי לפני הג'לציה. כדי להימנע מבעיה זו, יש להשתמש בפחות מ-15 מ"ג/מ"ל של חומצה היאלורונית מגולגלת וממיסים חומצה היאלורונית ממוססת תוך שעתיים מיצירת הידרוג'לים.
- יש להמיס 4-זרוע-PEG-מלימיד (PEG-Mal, 20 kDa) ו-4-זרוע-PEG-תיול (PEG-thiol, 20 kDa) במי מלח חוצצי פוספט (PBS), pH 7.4, להכנת 50 מ"ג/מ"ל PEG-Mal ו-PEG-thiol תמיסות סטוק.
הערה: זה לוקח לפחות 1 שעה כדי להמיס באופן מלא ריאגנטים PEG.
- אם מוסיפים פפטידים שמקורם ב-ECM, יש להמיס פפטידים המכילים ציסטאין ב-PBS כדי להכין תמיסת מלאי.
הערה: השתמש בריכוז מלאי של 2-4 mM.
- השרו תבניות גומי סיליקון באתנול למשך 20 דקות לפחות כדי לנקות אותן ולאחר מכן השרו אותן אוטומטית לעיקור.
3. הידרוג'ל קרוסלינקינג ואנקפסולציה של תאים
הערה: כדוגמה כאן, מתוארת האנקפסולציה של ארבעה הידרוג'לים בודדים, 80 מיקרוליטר עם 0.5% (w/v) HA ומודולוס דחיסה של 1 kPa3. ראו טבלה 1, למשל, מתכונים המניבים הידרוג'לים בעלי תכונות שונות: שני הידרוג'לים המשלבים את הפפטיד RGD קושר האינטגרין ושני הידרוג'לים המשלבים כובעי ציסטאין כבקרה שלילית לפעילות הפפטידים. ריכוז הזריעה של תאי GBM שמקורם בחולה הוא 500,000 תאים למ"ל.
- דלל את תמיסת מלאי PEG-Mal (50 מ"ג/מ"ל, משלב 2.2) ל-12.5 מ"ג/מ"ל על-ידי הוספת 40 מיקרוליטר של תמיסת המלאי ל-120 מיקרוליטר PBS. פצל את התמיסה המדוללת לשני צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל, כל אחד עם 80 μL.
- הוסף 16 μL של תמיסת RGD מלאי (2.8 mM, משלב 2.3) לצינור אחד ו 16 μL של תמיסת ציסטאין מלאי (2.8 mM, משלב 2.3) לצינור השני. מערבולת לערבב. הניחו את תמיסות PEG-Mal-RGD או PEG-Mal-CYS על קרח עד לשימוש בשלב 3.9.
הערה: ההליך המתואר כאן מניב הידרוג'לים עם ~ 140 מיקרומטר של פפטיד. זה שווה ערך לכ-1 מכל 8 זרועות PEG זמינות שנכבשו בפפטיד. ניתן לשנות זאת על ידי שינוי היחס המולרי של פפטידים עם סיום ציסטאין לקבוצות מלימידים זמינות. באופן כללי, ניתן להשיג ריכוז מרבי של 280 מיקרומטר של פפטיד תוך השארת מספר מספיק של קבוצות מלימיד זמינות לקרוסלינקינג הידרוג'ל.
- דלל את תמיסת מלאי PEG-thiol (50 מ"ג/מ"ל, משלב 2.2) ל-5 מ"ג/מ"ל על-ידי ערבוב 4 מיקרוליטר של תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל עם 36 מיקרוליטר PBS. הוסף 120 μL של HA מומס ותיולציה משלב 2.1 לתערובת.
הערה: הפתרונות של HMW HA צמיגים מאוד. לכן, אנו ממליצים להשתמש קצה micropipette רחב פתח כדי להעביר פתרונות. פיפטה לאט כדי למנוע מהתמיסה להידבק לדפנות קצה המיקרופיפטה ולשפר את דיוק המדידה.
- מניחים את התבניות הנקיות והיבשות (שהוכנו בשלב 2.4) בכל באר של צלחת בת 12 בארות שאינה מטופלת בתרבית רקמות. בעזרת הקצה הנקי והקהה של קצה פיפטה, לוחצים על תבנית הג'ל ובודקים שוב את האיטום בין התבניות לתחתית צלחת הבאר.
הערה: בדקו את האטם שוב ממש לפני העטיפה, כדי למנוע דליפה.
- מעבר תאי GBM בתרבית, ניתוק לתאים בודדים וקביעת ריכוז התא כפי שתואר קודם לכן3.
הערה: לא ניתן לנתק קווי GBM מסוימים לתאים בודדים. במקרה זה, גליומספרות שלמות יכולות להיות עטופות. עם זאת, הכינו תאים בודדים מנותקים לאחר ספירת תאים מדויקת כדי לשפר את יכולת השחזור. פרוטוקול המעבר של גליומספירה משתנה בין מעבדות שונות ורבות מהן ככל הנראה תואמות לאנקפסולציית הידרוג'ל.
- (מומלץ) גליומאספירות צנטריפוגות בגודל 500 x גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנאטנט והוסף 1 מ"ל של אנזים דיסוציאציה של תאים לכדורית התא. לאחר מכן, לדגור במשך 5 דקות, בעדינות להקיש על הצינור כדי להתסיס.
- הוסף 4 מ"ל של מדיום תרבית שלם (50 ננוגרם/מ"ל EGF, 20 נ"ג/מ"ל FGF-2, 25 מיקרוגרם/מ"ל הפרין, תוסף G21 ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין ב-DMEM/F12) לתאים.
- צנטריפוגה שוב ב 500 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. לבסוף, להשהות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של התווך המלא ולהעביר תאים מרחפים דרך מסננת תאים 70 מיקרומטר. (מומלץ) לשטוף את המסננת עם 4 מ"ל נוספים של המדיום השלם כדי למקסם את מספר התאים שהתאוששו.
- להעריך את ריכוז התאים בתרחיף באמצעות המוציטומטר. פצל את תרחיף התא ל -2 צינורות צנטריפוגה, כאשר כל צינור מכיל ~ 80,000 תאים. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות; באופן כללי, 80,000 תאים ירכיבו 2 הידרוג'לים של 80 מיקרוליטר.
- הסר את supernatant ו resuspend גלולה אחת ב 80 μL של תמיסת PEG-MAL-RGD וגלולה שנייה ב 80 μL של תמיסת PEG-MAL-CYS (מוכן בשלב 3.1).
- באמצעות קצה מיקרופיפטה רחב פתח של 200 μL, יש לפזר 40 μL של תמיסת HA (משלב 3.3 לעיל) לכל תבנית סיליקון גומי (כפי שהוכן בשלב 3.4).
- באמצעות קצה מיקרופיפטה רחב פתח של 200 μL, מערבבים את 40 μL של תמיסת תאי PEG-MAL-CYS או PEG-MAL-RGD עם תמיסת HA בתבנית. פיפטה למעלה ולמטה במהירות לא יותר מ 10 פעמים. חזור על הפעולה עבור כל תרבית ג'ל מוכנה.
הערה: שלב זה דורש תרגול, שכן הג'לציה הראשונית מתרחשת במהירות (תוך 30 שניות). פיפטה למעלה ולמטה תוך הזזת הקצה למיקומים שונים בתבניות כדי להבטיח ערבוב אחיד. יש לשמור תמיד את הקצה מתחת לרמת הנוזל כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. אין לערבב את התמיסה יותר מדי פעמים מכיוון שג'ל עלול להיווצר בתוך קצה המיקרופיפטה. ניתן לשלב PEG-MAL-CYS ו- PEG-MAL-RGD ביחסים משתנים כדי להשיג את ריכוז פפטידי RGD הרצוי.
- הניחו את הצלחת המכילה תאים עטופים בג'ל לתוך אינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C למשך 5-10 דקות כדי להבטיח את השלמת התגובה.
- הוסף 2-2.5 מ"ל של מדיום תרבית לכל באר עם ג'ל שנוצר. השתמשו בקצה פיפטה סטרילי של 2 μL או מיקרו-מרית, כדי להפריד בעדינות את התבנית והג'ל. השתמשו במלקחיים מעוקרים מראש כדי להסיר את התבנית מצלחת הבאר. החזירו את צלחת הבאר לאינקובטור התאים (37°C ו-5% CO2) לתרבית ולניסויים עתידיים.
הערה: משכו את התבנית אנכית כלפי מעלה כדי למנוע פגיעה בתרביות הג'ל. באופן כללי, בינוני בתרביות ג'ל צריך להיות מוחלף כל 3-4 ימים. היזהר לא לשאוף הידרוג'ל בעת הסרת המדיום. אם זו בעיה, אנו ממליצים להשתמש פיפטה העברת פלסטיק. אם מתוכננת הדמיית ביולומינסנציה למעקב אחר מספר התא, תאי GBM חייבים לעבור טרנספורמציה עם לנטיוירוס המקודד באופן מכונן לוציפראז לפני האנקפסולציה, כפי שתואר קודם לכן3. להדמיית ביולומינסנציה, יש להוסיף 1 mM של D-luciferin למדיום התרבית שעה אחת לפני הדמיית לומינסנציה.
